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尼康显微镜:多色共聚焦显微镜的光学像差和物镜选择

2013-10-16  发布者:admin 

优化的设计简化了激光共聚焦显微镜的程度上,它已经成为一个标准的细胞生物学研究工具。然而,激光共聚焦显微镜变得更加强大,他们也变得更加苛刻的光学元件的。事实上,导致图像质量的细微瑕疵广角镜的光学像差可以产生毁灭性的影响,在激光共聚焦显微镜。不幸的是,通常是隐藏的严格的光学要求,激光共聚焦显微镜的光学系统,保证了一个清晰的图像,即使在显微镜是表现不佳。光学制造商提供了广泛的显微镜物镜,分别为特定应用设计的。本报告演示了如何权衡参与物镜设计可以影响共聚焦显微镜。

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在过去的十年里,共聚焦显微镜已开发的技术仅限于专家在显微镜成标准的研究工具。它的增殖应用尽可能多的从激光共聚焦显微镜技术的快速发展,从成熟的商业共聚焦显微镜系统的用户界面。最新的系统是近交钥匙系统,即使是新手显微镜能迅速收集高质量的图像。具有讽刺意味的是,同样的技术发展也刺激了共聚焦显微镜实验生物学中蔓延推理解共聚焦显微镜的光学性能比以往任何时候都更重要的方式,使光学共聚焦显微镜的极限。

共聚焦显微镜的最常见的应用是比较分派或多个探头在同一个细胞的行为。这样的研究已经成为可能,能够有效地收集多种颜色的荧光,并开发新染料,延长有用的光谱,荧光显微镜,共聚焦显微镜的发展。根据显微镜的配置的不同,可能需要这样的研究,使用的光的波长范围从紫外到红外的光学元件。要求准确的彩色成像中得到了进一步的发展比色法定量显微镜,如荧光比率测量离子浓度增加。

 

避免色差的光学设计的方程,这也考虑单色像差和参数,如光子效率高,视野大小,视野平直度,工作距离,和深入含水生物组织的图像的能力只是其中的一部分。由于光学显微镜的设计体现了妥协这些不同的参数,制造商通常会设计出各种不同的显微镜物镜,与各代表一组特定的设计权衡和各适合特定的应用程序。这里讨论的研究表明,显微镜物镜的选择可以产生深远的影响,激光共聚焦显微镜实验结果。他们强调显微镜仔细选择的物镜是适当的实验应用的重要性。

 

一个理想的镜头将所有颜色的光集中到同一个点。在现实中,所有的镜头有色差,不同颜色的光都集中到不同的点物业。通过显微镜目镜观察样品时,这种缺陷使物体看起来有颜色的边缘。当成像彩色共焦显微镜中的样品,这种缺陷在颜色不同的激励照明被聚焦到样品中的不同点,并收集从样品中的不同点的不同颜色的发射。在图像平面的水平方向发生位移,称为横向色差,因此在不同的放大倍率不同的颜色。此问题可以被最小化,通过限制分析显微镜视场的中心。然而,垂直色位移沿焦轴,简称为轴向色差,整个显微镜视场。这显然​​是一个问题,任何研究人员尝试使用彩色激光共聚焦显微镜确定的相对分布多个探头。3示出了图1中的图像,通过彩色共焦成像的结果如何关键取决于显微镜物镜的性质。

 

数字提供了比较平场40倍的物镜,这是专为最高紫外线光传输性能,与100x物镜,平场复消色差透镜设计最大程度减少色差。比较的一个方面,从玻璃盖玻片面的反射图像的垂直系列收集,可以使用488647纳米的光。由于是由一个单一的表面反射不同颜色的光,无色差的透镜聚焦不同的颜色相同的焦平面。当重放的作为垂直的横截面,一个理想的透镜收集的图像将显示单个水平行中,这两种颜色完全重叠。在图1的上半部分(一)说明XZ截面的玻璃反射,与震源(z)的轴垂直方向,并展示该平场复消色差透镜100x物镜接近这个理想的工作做一个可信的,解决的图像两种颜色的光在彼此的0.1微米的深度内。相比之下,微创矫正40X平场物镜检测647纳米的光,约1.2微米以上的488纳米光的反射。玻璃反射的图像,647纳米光显示为红色,和488纳米的光,以蓝色显示。比例尺表示的距离为1微米。

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垂直差异的影响,这是明显的荧光。此面板的下半部分(图1a))示出了垂直的横截面有三个荧光团标记的有孔玻璃珠的图像卷。使用100倍的俯视复消色差透镜物镜成像时,三个颜色重合,从而在一个白,合理圆形的图像。与此相反,40倍物镜产生一个明显的垂直位移的红色(600纳米)或绿色(520纳米)的荧光图像,其中的远红光荧光(680纳米的排放量,以蓝色表示)。此外,轻微的水平位移的远红光的荧光反映横向色差。

 

本发明提供一种生物的试验片,优势的事实,即胞内体孵育细胞与荧光标记的内吞作用的配体可以被标记。在每个核内体中的大量的分子,可确保每个将包含相同的比率荧光探针。因此,内涵体生物样品中的颜色,将每个荧光反映相对荧光的贡献,因为他们目前次解析度对象提供了一个极好的彩色激光共聚焦成像测试。图1b)示出了彩色图像的细胞,核内体中,已标记的两个fluoresceintransferrinF-Tf的,发出绿色荧光)和Cy5-转铁蛋白(Cy5-Tf的远红荧光),使用100倍的收集平场复消色差透镜物镜。两个探头的共定位个人在不断的橙黄色的颜色是明显的内涵体和更加明显的F-Tf的(图1c))和Cy5-Tf的高倍率图像的比较(图d)条)。在这些图像中(图1b)至图1d)段),比例尺表示的长度为10微米。

 

然而,当切换到40倍的平场物镜时,在焦平面上的细微的差别是显而易见的,即使之间的红色和绿色的荧光标记的TF结合的荧光素和若丹明(图图2a))的细胞中,如图。焦平面之间的红色和绿色的荧光令人吃惊的差异导致的F-Tf的和Cy5-Tf的,现在似乎是完全不同的(图2b))的表观分布的差异。

 

对于谁是评估各种探头的相对分布的细胞生物学家,这些位移会带来灾难性的后果。焦平面上的差异,可以规避和总结整个垂直一系列的图像卷成一个单一的投影,这消除这两种颜色的焦平面上(图2c))的效果差异。在投影演示的每一个内体颜色一致的黄色在每个内体的两个探头的恒定比例。然而,由于此过程中丢弃所有垂直的信息,这是很少以适当的方式呈现共聚焦图像。轴向色差的影响,也可以最小化,通过测量不同颜色的轴向偏移,并适合于每种颜色的焦平面从收集到的图像相结合。此过程的一个例子,图2d)中所示,其中显示了绿色和远红光合并图像采集间隔1.2微米与40倍的平场物镜。在图2的图像的比例尺表示10微米的长度。实现通过组合从不同的焦平面的图像的校正是明显的,当比较各个探测器的图像,如图3所示。而图3a)和图3b)表示在采集图像的在相同的焦平面,比较图3b)和图3F-TfCy5-Tf的分布之间的一致性差,(c)表示远红光的图像可以被收集1.2微米更深的绿色荧光图像叠加。(图3a)至图3c)),在这些图像中的比例尺对应的长度为5微米。

 

虽然在不同颜色的光被聚焦在图像体积的不同点色差的结果,球面象差可以深刻地降低共聚焦显微镜中的信号。球差透镜轴向和周边的光线集中到不同的点,从而造成图像模糊的点光源。在共焦针孔相同的方式,有效地提高图像的对比度通过拒绝焦点外的光,它有效地消除了大部分的荧光成像的球面像差的对象。

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对于许多样品,球面像差的主要来源,源于浸没介质和安装介质的折射率之间的差异。直到最近,最高分辨率,最佳矫正显微镜物镜被设计为使用以石油为浸液。对于这些物镜,球面像差被最小化时,整个光路有浸油的折射率(这是与玻璃相同),并随距离累积到具有不同折射率的介质。由于大多数样品 特别是生物样品 被安装在明显低于浸油的折射率的介质,因此,球面像差限制使用油浸物镜的图象的卷的深度。

 

4显示了在共聚焦显微镜,100倍的油浸平场复消色差透镜的物镜是用来收集与F-Tf的标记的细胞的图像和安装,数值为0微米的深度处(在盖玻片的表面)中的球面像差的影响(图4a)条)(35微米)到水性介质中(图4b)条)。在这两种情况下,核内体出现急剧定义,但累计深刻地影响到水性介质中的光路35微米的球面像差,在图4b)的荧光信号。比例尺表示在图4中的每一个的图像的长度为10微米。

 

近日,光学制造商已经解决了这个问题通过用水作为物镜浸泡介质的物镜设计。对于水样品,浸泡和采样介质的折射率匹配使得球面像差的成像深度无关。这使得这些物镜,深受工作距离许可证,动辄数百微米到样品收集到的图像。这种设计的成功是图4所示的((c)和(d)项),显示图像与F-Tf的标记的细胞,收集为零(图4c)),或66微米到水性介质中(图4D)),用开水浸泡60平场复消色差透镜物镜。在此,水溶液样品介质的光的路径,通过荧光信号的影响。这种新一代的高数值孔径,平场复消色差透镜水浸泡物镜显著帮助共聚焦显微镜在三维生物成像实现其潜力。

 

这种水浸泡的物镜的色彩表现介于油浸平场氟和前面讨论过的平场复消色差透镜物镜。的玻璃表面的反射,在图5a)可看出,647纳米的光被聚焦约488纳米的光的0.6微米以上的上半部分的横截面的图像。卷收集了类似的模式为063微米到含水介质中表明,这种差异是独立的成像深度。

 

左下的图像,在图5中的(a)示出的远红光的图像的这种颜色的差异导致的三重标记的珠被移位的红色或绿色的荧光图像。在荧光珠的图像中,520纳米的排放量都显示为绿色,600纳米红色,680纳米(远红光)的排放量在蓝色的排放。在此面板中的右下部演示盖玻片厚度校正球面像差最小化,在这种物镜的极端重要性。由于球面像差的校正取决于通过盖玻片的光路的长度,它是根据盖玻片的厚度被设置领子调节。当左方的横截面的胎圈收集的衣领设置为测得的盖玻片厚度(174微米),在右侧的图像采集与衣领错误调整到150微米。结果从不当彩色设置严重衰减的荧光信号,并损害垂直分辨率的球面像差。虽然这种失调选择戏剧化一点,我们强调的是,这样的错误很容易,因为在实践中遇到的实际厚度盖玻片可以围绕其标称值相差超过40微米。正确的衣领设置只能确保通过测量单个盖玻片。在图5a)中的所有图像,焦距轴是垂直方向,比例尺表示的距离为1微米。

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在图5中(b)和图5c)所示的图像是一个字段的两个F-TfCy5标记 蛋白标记的细胞,并收集到水性缓冲液中为63微米的深度处。图中标尺为10微米,在这两个图像。虽然图像出现尖锐的,这一物镜的轴向色差的F-Tf的和Cy5-Tf的分布出现离散的(图5b))的效果。尽管如此,这些细胞的图像的垂直一系列的投影(图图5c)),表明两个探针同样标注全部内涵体。在与图5中所示的反射图像(一),轴向色差也同样明显的图像中的内涵体零微米的深度处(在盖玻片表面)收集。差别不大的在焦平面上的红色和绿色荧光图像中的内涵体标记的TF结合到荧光素和若丹明(图6(一)),但F-Tf的和Cy5-Tf的观察再次出现标签内涵体的离散人口(图6b)条)。

两个探头的分布,可以得到更好的允许时,焦平面的差异,并用荧光素图像收集深0.6微米结合Cy5-Tf的图像进行比较。现在很明显的内涵体示于图6c)在恒定的黄色两个探头的共定位。采集图像(图6d)和图6(五))在一个单一的焦平面中所示的两个探针的分布明显的差异消失Cy5-Tf的图像进行比较时收集的F-Tf的图像,深0.6微米(图6f)条)。图中标尺为10微米的长度在图6a)至图6c)中,对应图62)通过图6(六)中的5微米。

 

色像差的影响,也可以通过测量图像中的内涵体标记与多个探针的荧光比量化。比直方图的半对数图在图7a)与FR-TF标记细胞,采集的图像使用100X平场复消色差透镜(红色曲线),40X平场氟(蓝色曲线),和60倍的平场复消色差透镜水浸物镜(绿色曲线)。图7b)显示与F-Tf的和Cy5-Tf的标记,使用相同的三个物镜的细胞的比率直方图。图7a)可以看出,若丹明荧光素的比例(红色到绿色)的排放量是合理的恒定的所有三个物镜。与此相反,图7b)示出100倍的俯视复消色差透镜,虽然仍显示变化最小的Cy5的荧光素的比例(远红色到绿色),60倍的水浸泡俯视复消色差透镜能显示出更多的变化,和40倍氟显示的平场甚至更多。60x平场的复消色差透镜和40x平场氟色差的影响更加明显,当为一个单一的焦平面的分布进行比较,以突起的垂直图像序列的每一个物镜(图7c)和图7中所测量(四),分别)。在每一种情况下,在所投影的图像的荧光比分布窄报告几乎是恒定的比例,在核内体中的两个探头在任何单一的焦平面的图像,这是不正确的。

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研究提出了色差和球面像差如何生动地展示危及聚焦成像性能。在同一时间,他们强调物镜的选择,在共聚焦显微镜的极端重要性。差的颜色校正将导致错误的解释的相对分布的多个探头,激光共聚焦显微镜的主要应用之一。比量化还演示了如何的色差妥协显微镜定量。球面像差造成的不匹配的浸泡和样品介质恶化垂直分辨率和完全可以抹杀荧光检测。虽然尤为明显,激光共聚焦显微镜中的高对比度的图像,这些错误也损害常规落射荧光和透照技术所收集的图像。

 

主要特点一直紫外线荧光色差。其他研究结果表明重大轴向色差远红为好,越来越多地使用显微镜的发展新远红荧光探针和激光能够激动人心的范围。尽管这些研究提出涉及表征点源容易地显示,这些样品的问题,这将是更广泛的探头清单(但不一定有明显)。这样的探针包括胞浆中经常使用的荧光比率测量离子浓度的染料。

 

例如,由488纳米的光激发荧光SNARF-1胞浆pH指示剂,pH值的测量是从荧光的比值在580纳米到640纳米。对于薄的细胞的细胞内pH值的测量,这是容易想象有可能会受到的单元格的位置,相对于单独的焦平面绿色的激发光,红光和远红光发射荧光的比率。虽然这些错误经常会简单地增加测量(两倍或三倍提出的量化标准偏差)的变化,他们也可以系统性影响比测量,例如,当比较不同厚度的不同部位的细胞的比例。

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色差的最终后果,虽然不是这里讨论的,是如何影响荧光检测。在共聚焦系统的色差,激发和发射波长激发一个卷不同的卷的成像结果之间的差异,荧光信号的衰减。对于束扫描系统(大部分共聚焦显微镜)离轴距离与信号恶化,这方面的损失共焦针孔成像点聚焦越走越远。

必须强调的是,这些观察结果不是唯一的,以用于在所给出的数据,或特定制造商的具体物镜。刻画的彩色校正相同再现60倍水浸泡的物镜,并在三个例子,两个例子既的QuantumDIAPHOT显微镜看台上100倍油浸物镜。从每一个主要制造商的物镜已确定在显着的轴向色差。事实上,无处不在的色差地址色差通过实行特殊辅助矫正镜片,或完全避免折射和反映物镜转向替代显微镜设计的发展。尽管如此,光学显微镜可能继续发展,并初步经验,CFI60光学系统新一代的尼康公司表示,轴向色差校正大为改善。

 

从表面上看,它可能会出现一些物镜仅仅是比别人更好。然而,如前面所讨论的,物镜的设计代表了一种妥协的设计参数。因此,每一个物镜的反映出一组不同的设计妥协,根据物镜应用。尽管如此,它是可能的,研究人员将需要比目前可在光学设计,迫使它们来设计的实验,不进行拉伸的物镜设计的限制。

如果油浸物镜必须使用在水性介质中的图像的样品 例如,在活细胞的研究 球面像差可以通过最大限度地减少通过在水性介质中的光路,或通过使用油状的折射率,可以最小化适合的球面像差引起的光路水溶液。

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色差问题,可以尽量减少在几个方面。如果一个特定的实验中需要使用一个物镜的具有显着的色差,最明显的解决方案是简单地避免了使用远红荧光的染料如Cy5的共。在本次审查讨论的结果证明所有的测试物镜之间的绿色和红色荧光令人满意的协议。在一般情况下,最好是使用染料与某个特定的物镜已得到纠正附近的特定波长的最大激发和发射。第二个解决方案,如上所述,是,收集每个荧光图像在垂直焦平面系列,并结合不同颜色的图像,根据焦平面两者之间的差异。这是一个简单的解决方案,但不会是适当的快速图像采集时,是必要的,因为与活细胞。此处未示出的分析也表明,这种解决方案不具有足够的精度,以用于校正图像比定量。(或更少普及)甲更昂贵的解决办法是使用双光子显微镜,本质上是由色像差的影响,只要没有检测针孔用于。然而,它的多色能力只有现在正在探索。