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徕卡显微镜:共聚焦荧光门打开,STED超分辨率

2013-10-16  发布者:admin 

真正的共聚焦显微镜照明系统提供单点,单点检测。该方法被称为“光学切片”,因为生成的图像只包含信息的焦平面。串行检测提供高效,低噪音的传感器信号转换。虽然非平行检测不利于高速成像,现代扫描的概念允许的帧速率每秒400帧在合理的噪声水平之上。这是远远不够的大多数应用,包括物质生活的快速离子输送现象的监测。

光电子倍增管(PMT

到今天为止,最常用的传感器,激光共聚焦显微镜的光电子倍增管(PMT),提供低噪音电子信号,在大范围的照明强度。光电倍增管的主要缺点是相对较低的量子效率〜30% 在最好的情况下,经典的光阴和为砷化镓分层光阴不超过45%。由于后者引入非常高的不稳定性,使这些设备容易受到损坏,有严重的缺点,因为这些设备的成本高。

如果光子被吸收通过光电阴极,如果光子的能量足够的游离的电子从阴极材料,该电子加速电势向正电极。在光电倍增管中,在正电极的顺序排列的一系列的倍增电极。在每个步骤中的典型的电势差是100伏。最后在阳极收集的电信号。加速电子入射时,倍增极发行的电子数,即,乘以吸收电子。的乘法因子依赖于倍增极之间的电位差。(阴极与阳极)的总电压是可调的最多约。1000伏。倍增电极的数目通常是6 ... 12,电压倍增电极的数目除以。

在阳极收集和集成的模拟信号的另一种测量模式是光子计数。这里,由一个比较器电路的信号进行分析。较单一的二次电子引起的单个光子的峰值识别和计数。,虽然光电倍增管的第一个装置,让光子计数,他们缺乏高频特性,这意味着它们只适用于光子计数非常低光水平(单位时间内的光子很少)。


Figure-1_09


图 1:左:的PMT的示意图。与光子的相互作用时,被释放的光电子从阴极和中等电压的第1倍增电极加速。这里有几个次级电子被释放并加速到下一个倍增电极。最后,该信号被收集在阳极上。右:示意图的路政署TM。与光子的相互作用时,被释放的光电子从阴极和高电压的半导体靶加速。这里的动能被耗散在一次,此外,电荷被放大的倍增层(雪崩效应)。最后,该信号被从阳极收集。

 

混合探测器(路政署™)

 传感器技术的最新发展提出的嵌合体真空技术(如光电倍增管)和硅技术(如雪崩光电二极管,雪崩光电二极管)。这些杂交 在激光共聚焦显微镜徕卡显微系统,将它们命名为“路政署”(pron.highdees)。路政署传感器配有一个砷化镓光电阴极,但只使用一个加速度的步骤,而不是一个序列的倍增电极。所施加的电压是约。8000伏。这种设计减少了传感器的脆弱性和损坏的风险减少一些数量级 虽然量子效率高达45%。

被加速的电子的动能完全被消耗硅靶上,并立即给出了一个约。1500倍放大。与经典的倍增电极,最好允许的35倍的扩增(和需要被测序出于这个原因),这是不可能的。乘法层,它转换成一个雪崩二极管,硅组件终于无需外部(噪声)放大电路放大信号,可测量的强度。

 

LightGate

其中的诸多优点的的路政署传感器是高截止频率,这使得路政署在光子计数模式操作,即使在相对较高的强度水平 无论如何是典型的在生物医学研究和常规的标准荧光灯样品的强度。这一事实打开门控模块,用于将检测信号。

为了获得从门检测,照明光源有脉冲。这是一个固有功能的白光激光共聚焦显微镜系统推出徕卡显微系统于2007年由(WLL) 。此源设有八个独立排放bandlets的,这两种颜色(目前为470 ... 670纳米)和强度都独立可调。源脉冲频率为80 MHz -这是一个良好的开端激发可调FLIM测量以及。

 Figure-2a Figure-2b

图 2:影响抑制反射光门。左边的图像显示一个配置文件(XZ)荧光标记的细胞部分。收集的光在发射带和激发带。滑动面的反射和盖玻片是显而易见(强大的水平线)。右图:不改变发射带,光闸完全抑制这些反射。

 

选通所述检测信号允许信号采集期间,仅在激励脉冲之间的荧光发射时间。不包括脉冲,由激发光产生的背景被有效地抑制,并且独立于任何分束或阻挡过滤。这LightGate是一种新的建筑块在“白焦”的概念,指的是完全可调,无滤波器的频谱光学切片设备。

Figure-3
图 3:门控策略。左:激励脉冲后,唯一的排放物LightGate收集光子。这有效地抑制了独立的波长的反射光。右:封闭式STED只收集下旬发射光子的荧光寿命长的照明模式,并暗示进一步提高分辨率的中心事件,以确保限制。

 

 

Figure-4_03

图 4:甜甜圈型的的STED强度导致排放终身依赖。的中心(STED强度为零)表示最大生存期,从而降低与离中心的距离。最终的寿命不再相关,作为激发是零,由于衍射极限的激励模式。

 

封闭式超分辨率STED

第二个领域HyDs实益门控模式实现STED  超高分辨率成像。受激发射损耗的基础上受衍射限制的斑点与荧光团的激发波长,同时照明的环状区域的波长,导致去励磁(受激辐射)的照明。这样的安排,使得只有一个子衍射区域处于兴奋状态,因此允许更高的分辨率比衍射极限的探测。

在本质上,两个光质竞争的激发和去激发。如果有没有激励光,在激发圆的叠加和受激发射损耗环的中心,荧光基团发出荧光特征荧光寿命τ后,单纯依赖的荧光量子特性的影响和环境的影响。中心外的第二条路径的激发态返回:受激发射。因此,特性的寿命缩短。缩短取决于受激发射损耗的强度,因此增加,直到达到最大强度,但是这是已经在激发区域的边缘)的距离从中心(。

其结果,特性的荧光寿命是半径依赖性中的受激发射损耗集中在中心的最长的寿命。通过删除早期的光子,这最有可能从外部中心发射,观察面积进一步减小-这是与更高的分辨率相同。

Figure-5

图 5:门控STED(从左至右)的影响。76 nm的间隔荧光DNA折纸不能分开用标准的共聚焦成像。在CW STED,分辨率足以分开76纳米。当收集的排放量只有0.5纳米激励脉冲后的分离进一步提高(提高分辨率)。后来的集合,这里从3.0纳米,单产额外的分辨率提高。

 

STED_CW_Conf_Comparison2

图 6:双色共聚焦和双彩色STED形象:绿色,组蛋白3红,微管。双方可视做Chromeo 505BD地平线的V500,分别在HeLa细胞。