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尼康显微镜:EPI-荧光照明光路

2013-10-16  发布者:admin 

直到最近,荧光照明是一个选项仅适用于配备专门的高数值孔径物镜的研究级复合显微镜。这一技术在立体显微镜的需要不断升级与引进的编码基因和生物特异性荧光蛋白GFP(绿色荧光蛋白)等。

stereo fluorescence figure1

体视显微镜的应用GFP观察现在是如此普遍,立体声荧光照明,更经常被称为GFP照明,即使他们可以利用许多其他应用在生命科学和电子制造业。大幼虫,线虫,斑马鱼,卵母细胞和成熟的昆虫标本,如可以方便地选择和操作时,他们GFP标记的照亮荧光技巧。荧光照明揭示生物体产生荧光蛋白耦合到一个大领域的视野和充足的工作距离和立体视觉,使观察员进行实验,用钳子,移液器,或显微操作。其他更传统的标本也很容易观察和记录使用立体显微镜荧光照明。

 

落射荧光照明功能的方式是类似上采用更复杂的复合显微镜体视显微镜上。通常情况下,在荧光照明器由包含在经由中间管(或垂直照明,其安装到显微镜外部灯箱的氙灯或汞弧灯,见图12)之间的的显微镜放大本体和观察管定位。目前仅限于这种类型的照明采用共同的主要物镜CMO)立体显微镜的应用,因为它不是可以使用的市售的零件,以适应一个的格里诺或聚光型体视显微镜荧光照明。

 

弧灯产生的光被引导通过一个可调节的聚光透镜的组合过滤器块(图2和图3中示出),它允许唯一的光具有特定波长范围内(或带通),通过容纳在激发滤光片。过滤的光,然后通过显微镜成像的下部的显微镜(放大的身体和客观的在体视显微镜)的路径和到标本偏转,也调谐到选择性地过滤由二色镜,反射,和/或发送一个特定的波长区域设置。的术语二色性(或二色性)是指过滤器或反射镜的能力来区分两种颜色的范围,超过该限制反射特定波长极限以下的颜色,而这些波长发送。

stereo fluorescence figure2

聚焦的激发光通过显微镜放大主体和物镜,在那里形成一个倒锥形的照明,沐浴试样,令人兴奋的任何存在的荧光基团,并且有对应的激发波长的带通范围内的吸收带的。二次荧光发射(通常比的激发光更长的波长)从试样发出的捕捉体视显微镜的常见的主要物镜,并通过放大机构和阻挡滤波器直接回,块激发波长,并只允许一个选定的区域发射波长通过。在图1和图2中的显微镜体管构成,波长较长的荧光发射光通过左侧和右侧的放大光信道传递到达落射荧光照明器之前独立地集中。光从左边的通道直接穿过屏障过滤器前观察管或直接进入到相机端口。与此相反,右声道的光从第一行驶回然后通过二色镜的屏障过滤器和目镜。此灯不到相机端口的途径,只能用于观察标本。

 

列于图23的荧光过滤器的组合块的结构细节。每个块包含一个单一的激发滤光器,两个屏障过滤器和一个二色镜。汞弧灯产生的光通过激发滤光片进入块,如上所讨论的,图3中所示的二色性反射镜的表面被反射。次级荧光发射通过阻挡过滤器。激发光滤光片,二色镜,用于左声道的屏障过滤器粘到的地方,但是,用于右声道的屏障过滤器被安装在一个小的帧可以通过拧松固定螺钉的一组从块中删除。卸下屏障过滤器框架允许访问定位在过滤器内的块的二色镜。当粘合成块,更换过滤器小心,不要蔓延到过滤器表面的胶水和不持有的过滤器或双色镜用没戴手套的手,以避免污染的表面油腻指纹。

 

荧光垂直照明可以容纳三滤的块和一个直径过滤虚拟块(没有过滤器),使正常的明场观察。过滤器块被安装在滑动架中,并且可以被插入到光路中,是用来控制齿条位置的杆通过。每个块都有一个附带的识别板,其可插入顺序排列,以使操作者能够容易地选择适当的块,用于荧光观察的照明装置的外部壳体上的插槽。

stereo fluorescence figure3

目前,尼康提供一个适度的过滤器组合的阵容,这是表1中列出。这些过滤器涵盖了广泛的荧光激发和发射条件,应该是有用的许多普遍使用的荧光探针在生物学研究。该过滤器的组合,也适用于工业应用,如荧光照片污染集成电路晶片检查抗蚀剂聚合物。激发波长介于380510纳米荧光探针,可以用来选择合适的激发/发射过滤器组合(见表1)。该过滤器的组合也是非常有用的研究,采用各种绿色荧光蛋白的突变体,包括青色和蓝色的版本。

 

在活的细胞培养物,具有荧光蛋白标签,可以显着提高的信号强度,过滤器的组合时,是严格匹配的荧光激发和发射的档案。例如,在DS-红信号,视觉和图像传感器检测到的红色荧光的情况下,可以显着提高的红色信号通过转移更多的橙色发射。此外,专为植物标本具有强烈的自体荧光背景叶绿素排放的过滤器组合往往受益于仔细和精确的选择过滤器的规格,就到相应的信号发射。显微镜工程师采取许多这些设计标准时考虑到他们正在优化波长带通过滤器组合体视显微镜地区。

 

体视显微镜荧光滤光片组合

设置过滤器

激发
波长范围

二向色镜

发射
波长范围

蓝绿色荧光蛋白/ DAPI

379-401纳米

420纳米(DCLP

435-485纳米

青色(EGFPGFP

426-446纳米

455DCLP

460-500纳米

赋予GFP带通

HQ 450-490纳米

Q 495LP

500-550纳米

赋予GFP长通

HQ 450-490纳米

Q 495LP

500纳米(LP

TRITC(红色荧光蛋白)

HQ 530-560纳米

Q 570LP

590-650纳米

黄绿色荧光带通滤波器

HQ 490-510纳米

Q 515LP

520-550纳米

1

 

组合块过滤器和其它敏感的干涉滤光片,将随时间而变质时暴露在高强度的光,紫外线的波长。作为带通频率和传输值的特性,例如,如果过滤器被暴露于高湿度条件下也可能受到影响。为了增加这些过滤器的使用寿命,他们应该被储存在干燥器中或含有干燥剂的密封容器中。另外,还可减少光通过过滤器的保持照明快门关闭标本时不被直接观察或用数码或胶卷的照相机系统成像的时间量。该过滤器只应用干燥空气清洁从耳气球,软驼刷,或无油的加压气瓶。不要试图擦拭镜头纸过滤器,以避免划伤或擦伤,软干扰涂层的表面。

 

尼康SMZ1500如用立体显微镜,广泛的标本,可以在荧光照射下成像。物镜的放大倍率为0.5倍至15倍的1.6倍的变焦跨度,在显微镜能够540X,考虑到的一个经典的化合物显微镜体视显微镜观察范围内,共提供4倍的倍率广度。这种广泛的纬度使显微镜的放大倍率形象都大活标本和荧光标记的薄切片在显微镜玻片上安装微小的细节上。荧光观察的高倍率范围内的一个例子示出在图4中的三重标记的小鼠肾组织的粗节。标记的Alexa Fluor 488WGA,用DAPIAlexa Fluor 568(得自Molecular Probes公司的Alexa Fluor探针和试样)试样,并使用三个过滤器的组合列于表1蓝绿色荧光蛋白/ DAPI,成像赋予GFP的带通滤波器,和TRITC DsRed。此图片清楚地说明了高倍率能力原本准备复合显微镜观察标本的荧光体视显微镜。

stereo fluorescence figure4

其他体视显微镜制造商提供替代照明策略,激发和观察。最流行的配置,如图5所示,荧光激发,不利用显微镜的成像光学系统包括一个外部通路。照明从电弧灯箱的第一通过激发滤光片,然后通过管定位在主显微镜主体的后部。管的下部配备的透镜系统,引导到样品上的激发光波长。此配置可确保光线被直接引导到标本在所有倍率变焦位置,提供所有倍率同样强烈的荧光照明均匀暗背景。

 

从被捕获的标记的试样中荧光发射通过的共同的主要物镜(图5),并通过变焦频道和屏障过滤器定位在显微镜头成一组。从那里时,光被引导到目镜直接观察或成数字成像或显微摄影摄像管。此配置中的主要好处是缺乏的二色性反射镜的一个要求,和独立于预先配置的过滤器的组合块,这使得研究者有所更自由地进行过滤器的选择。但是,配置也可能导致错误,缺乏经验的运营商试图观察标本不正确的过滤器组合。

stereo fluorescence figure5

强烈的紫外线辐射所产生的汞弧灯作为光源,在荧光显微镜利用观察者的眼睛的视网膜,可以造成损坏。为了避免这种情况,许多显微镜制造商包括保护装置在显微镜体,可过滤紫外线光洗澡标本在显微镜舞台上。其他的安全预防措施,包括紫外线阻隔过滤器观察路径和杂散光保护周围的灯箱。此外,假人过滤运营商往往是空置过滤器的位置插入荧光干扰过滤器滑块和旋转框架设计。

 

荧光体视显微镜通常配备停止定位介于汞灯箱和阻挡有害紫外线辐射的垂直照明从灯标本时不被观察或成像光。此停止应始终被插入光路时,不进行观测。

反射,或热点可以发生在使用复消色差物镜更高的放大倍率(1.6倍至2.0倍)的标本,在荧光立体显微镜观察时的视场的下部。此神器通常是唯一可见的变焦比率较低时,往往消失的变焦倍数增加。在大多数情况下,反射问题不发生较低倍物镜(0.5X1.0X),无论光学校正因子,通常缺席下校正(消色差透镜和计划消色差透镜)的高倍率物镜

 

存在范围广泛的应用程序荧光调查,利用体视显微镜,列于表2。受益于这种观察模式标本的数量是相当大的,涵盖广泛的学科,包括那些从生物领域到工业制造商不等。

荧光立体显微镜的应用

领域

应用

生物学

基因表达,细胞分选,解剖,发育过程,眼睛和肌肉调查

植物学

植物细胞,组织自体荧光,土壤样品和寄生虫

药理

毛细管流量,药物,ELI观察

水文学

水质,细胞结构,滤膜分析

农学

种子观察,基因的表达,并Transgenetics

电子

锡膏,环氧树脂分析,监控涂料,聚合物铸件集成电路

半导体

抵制污染,杂质颗粒,过程错误

聚合物

外来颗粒,空洞,珠分析,非聚合区

金工

裂缝和表面缺陷,污染,焊接控制,断裂分析

物料

裂纹,焊接,粘接碳,骨折,取向研究

造纸

光纤涂料和夹杂物

取证

纺织纤维,体液,指纹,银行票据,伪造

2

荧光观察在立体显微镜提供的独特的属性的三维观察时相比,提出的一个古典化合物显微镜的视图。此外,更大的工作距离和景深立体技术所提供的启用更宽的全景视图字段和更强烈的荧光。这些功能是巨大的利益,调查人员正试图处理大量的生物标本和材料的技术人员正在开展准备工作,如嵌入,电子检查,或切割。作为更清楚地定义的过滤器组合成为可用于专门的应用程序,利用荧光立体显微镜继续攀升。