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徕卡显微镜:共聚焦显微镜的最终来源白光激光束

2013-10-16  发布者:admin 

共聚焦显微镜在生物医学应用的理想光源应如何执行?它应具有足够的强度,可调谐的颜色同时激发的一系列样品。此外,它应该是一个脉冲光源寿命荧光实验。已经发明这种源:白光激光器。它由一个高能量脉冲IR被馈送通过光子晶体光纤的光纤激光器,产生的光谱的连续。小bandlets选自该连续的声光可调谐滤波器的装置。该仪器提供足够激烈,像一个普通的激光束 这是衍射极限照明的要求,可调焦的光。它允许通过频谱从蓝色到红色的颜色的连续调谐。八并行可调颜色为标准。,它提供了一些额外的好处,这是由于由脉冲的能量发射。它本质上是一种基于单光子荧光寿命成像源。并且它允许抑制在检测信道的激发光通过玻璃 自由电子发射滤波。

Fig_0_Lambda_square_01

超连续谱白光光源

古典激光光源通常只提供一个单一的窄的发射。某些气体激光器可以同时发射了几行。最著名的例子是氩气体激光器,这可能是有5条线中的蓝绿色的范围内。其他类型的激光器,染料激光器一样,是可调谐的,但一次只发射单一的颜色。此外,染料激光器是非常不稳定的,需要一定的耐心才能正常运行。有全固态激光器是可调谐的,但仅限于红外范围(如钛萨激光器)。除了其高复杂性和昂贵,他们也可以只发出单一波长的时间和调整过程是很慢的(多少秒)。

这种情况已经完全改变了本发明,同时在很宽的范围内发射的光源,但仍像激光器在可聚焦。

这些源采用了光纤红外激光发射光脉冲在大约80兆赫。这种化合物被用于作为“种子”,即提供了一个精确的时钟,但具有相当低的能量。一个二极管泵浦的激光放大器中放大,其后的脉冲。放大激光也是基于光纤的,两个系统都无缝耦合光纤熔接。放大器的输出可能会达到约10 W的红外光的平均功率,但切碎约脉冲。200 PS80 MHz。这种高能量的脉冲,最后集中在一个所谓的光子晶体光纤(PCF)的入口表面的。这些纤维具有在纤维的中心的空心管的图案的。强烈的非线性过程在单色光扩散成一种广谱达到蓝色或什至紫外线管图案的表面,导致包括群速度色散(最多顺序排列),自陡,拉曼散射和等离激元的裂变。

根据不同的PCF的长度,单色红外峰频谱扩散到高达几百纳米。典型的纤维长度为0.52米。

WLL-Figure-1_04

图 1:左:光子晶体光纤横截面。空心管的中心图案是复杂的非线性光子相互作用产生的光子能量广泛的空间。
右:白色的激光所产生的放大红外脉冲激光,这是美联储通过光子晶体光纤。PCF是一个坚实的超连续谱发生器。连续体的宽度取决于光子晶体光纤的长度-以及许多其他的工程细节。所有零件的基于光纤的固有的免维护。通过棱镜产生的PCF的出口处的频谱,并投射到一张纸上。

颜色和强度的两维声光调谐

就像在任何其他的显微镜,使用白色荧光照明源,白光激光共聚焦显微镜[需要一种手段来选择颜色,具体地激发各种荧光染料。如果可能,多种颜色是非常有用的并行乘法染色样品的激发。在宽视场荧光显微镜中,这个任务是由激发光滤光片。具有3个或4个传输频带dichroitic过滤器用于多染色样品。

从超连续发射的光束提供一个更灵活的解决方案。的声光可调谐滤波器可以挑选出的频谱单行(这实际上是一个狭窄的扁带),并转移到一个不同的方向。频谱的其余部分将通过晶体直行。由于颜色的扁带是由机械激发频率控制的偏转,从输入频谱可以选择任何颜色的无级可调。该扁带的宽度是约1 ... 3纳米的波长而定。这样的细带中的能量是在几毫瓦,这是足够远成像的和经常使用的,即使对于FRAP实验的范围内。通过添加更多的电子驱动器,以产生在晶体中的机械波,它是可以直接到为了同时一系列颜色。八色同步标准(但不是技术限制)。这些bandlets中的每一个都是可调谐的波长和强度。

这种组合使白光激光共聚焦显微镜激发WLL的理想来源。它将为所有已知的染料在可见光范围内激发,它允许记录激发光谱探索新染料的光谱特性,尤其是在原位。和它给自由调整激发离峰,如果这是需要的发射收集的原因或提高分离相邻的染料。

WLL-Figure-2_01

图 2:采用的声光可调谐滤波器,提取了一系列的各种颜色的bandlets的超连续谱源的白色发光。可调谐这些bandlets是在颜色和强度。同时使用了一些bandlets需要并行乘法染色样品的激发。

声光分束(AOBS)可以做的工作

WLL-Figure-3

图 3:只自由可调谐分束装置可有效地作为依赖于波长的激发和发射阀,用于当使用一个可调谐源。声光的分束器,可以无级调节,同时适应任何给定的一系列激发颜色。

 

激发颜色自由可调性方面非常有利的启动一个新的挑战:什么样的设备可以喂饱无级调谐到入射的光的荧光显微镜的光路中的光?最简单的方法是使用一个灰色的分束器,但这将是:总是失去态激发能的目标部分的牺牲 尽管这是较小的问题。这种方法的严重缺点是宝贵的发射光的损失。即使使用灰分离器80/20(这将浪费的激光能量的4/5)的排放量的五分之一将被牺牲掉。

一个单一的分色镜,即使有多个频段,显然不可能支持一个可调光源的好处。一个单一的排放慢调谐的一种方法,已经商业化的非连续光源。该系统采用了约序列。10二向色反射镜,将用于在其工作频率 给只有10种,满分为200的范围内 而它们也可用于指定的波长的两侧。这使得一共有30种颜色,但明显低于完美的表现。

这种困境的一个完美的补救办法是使用声光。声光可调谐光束分离器(AOBS)是一种装置,允许的光路与超过95%的效率,而频谱的其余部分被引导到不同的方向,被送入一系列的颜色bandlets。在一个多扁带的可调谐激光器的情况下,如操作AOBS使得激发的颜色传递顺序作为激发光束路径的进入。 

将被有效地传递到检测路径的完整的发射光谱。线程化所需的在样品上的激发扁带的透射光谱中的空隙的扁带本身(因为它们所产生的相同的技术)相同的尺寸,同时可控制在它们的位置:只要一个曲调的激发颜色,适当的平行的电子调谐相应的间隙。无需任何操作者的操作是必需的。

的声光可调谐分束器,因此最终的耦合装置,用于可调谐多色激发。

激发和发射光谱的强度和荧光寿命

光谱检测仪(SP)是专为带宽和完全控制中心检测到的发射谱带颜色。这可以保证最高的吞吐量(传动效率高)和最佳分离。作为一个副作用,SP检测器允许记录的发射光谱,以及 5个通道)可以同时或依次(多达400个),或这两种方法以混合模式。在过去,被绑定到安装在系统中的激光器所发出的几行的发光颜色。随着白光激光器(WLL),情况已经完全改变:颜色1nm的精度可调,顺利激发谱是整个可见光谱。在与SP的检测器,它能够适应伺服控制的激发波长的组合,这种测量是完全自动进行。它是合理可行的实施声光分束器引导激发和发射光。

有一个可调的激发和一个可调谐发射,下一个步骤是创建一个二维的强度相关的地图[。这拉姆达方地图是特别有用的复杂混合物的荧光染料时,需要分开。这也是一般价值荧光染料时,需要的特点-要么是因为他们的新发现或设计,或者是因为由于微环境条件下,感兴趣的频谱改变。

特点是荧光发射强度和荧光寿命。要确切衡量寿命,脉冲光源是必需的。幸运的是,白色光的激光是一种脉冲源,脉冲频率适合的典型的荧光寿命(0.5 ... 5纳秒的范围内)的需要。如果需要更长的脉冲间隔,脉冲选择器降低脉冲频率。当然,白色光可调谐激光直接呈现终身激发光谱,包括下一个合乎逻辑的后果:一个二维激发发射终身地图。

Fig4_zusammen

图 4:记录,可将6个不同颜色的有孔​​玻璃珠。左:假色由一个激发发射λ-方扫描记录,可在有孔玻璃珠的凸起。右:伪三维视图的激发发光的地图(荧光横向)。人们可以很容易地找到六种不同的荧光染料(箭头)的峰值。

光门 全色电子屏障过滤器

最后一件事启用了最新的技术。混合探测器(HyDs)非常敏感,快速,覆盖一个大的动态范围。他们提供了一个门控操作模式。在脉冲白光激光的结合,它是现在可以只在光脉冲之间的时间间隔来检测荧光发射 只是由门混合检测器的收集没有在激光脉冲的信号。然后,检测到的信号是纯荧光,并且不包含任何反射光。这一做法,剩余反射的颜色对抗轻松拿下。有没有必要限制排放留出了足够的空间,以激发颜色集合。它甚至有可能激发下方直接测量 和超越,然后允许反斯托克斯发射特性。

脉冲和光谱可调白光激光光源,结合声光可调分束器,可调SP探测器和门控混合探测器是一个巧妙结合最新的技术。而且,虽然这句话听起来可能有点穿,它适合在这里:它革命性的概念和操作共聚焦显微镜。

Fig_5_02

图 5:通过门控检测,也能够非常有效地,纯粹只记录从样品中的荧光。混合探测器(HyDs)作为完美的传感器在这方面。在收集数据期间被分配的激发脉冲,并因此只有发射的荧光收集。左图:录制的绿色荧光激发后,在492 nm处。排放收集490-600纳米。主信号的反射光作为激发波长为的集发射频带内。右图:相同的激发波长和发射集合带,但光门。没有反射光被记录下来。纯的和明确的荧光发射,,不管发射带。