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奥林巴斯显微镜:DIC显微镜的基本概念

2013-10-16  发布者:admin 

活细胞等透明,未染色的标本往往是难以观察到,在传统的明照明下使用全孔径和分辨率的显微镜的物镜和聚光系统。,首先在20世纪30年代开发的釉泽尼克相衬,经常使用这些具有挑战性的标本图像,但该技术受到晕文物,被限制到非常薄的样品准备,不能利用充分聚光镜物镜孔。

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基本差干涉对比(DIC)的系统,在1955年首次由Francis史密斯设计,两个渥拉斯顿棱镜附加的,一个聚光镜的前焦平面的变形的偏振光显微镜物镜的后焦平面的第二上面的(参见图1)。几年后,乔治诺马斯基,波兰出生的法国物理学家,修改了标准的的沃拉斯顿棱镜配置使这些极其薄的光学元件的物理位置远离光圈共轭平面。

微分干涉对比显微镜的光学元件不掩盖或以其他方式阻挠的物镜聚光镜孔(如相或霍夫曼调制对比),从而使仪器能够被完整的数值孔径。其结果是分辨率显着改善(尤其是沿光轴),消除晕文物,并有能力产生极好的图像比较厚的标本。此外,微分干涉对比产生一个图像,可以容易地控制使用的数字视频成像技术,以进一步增强对比度。

1中显示的是典型的微分干涉对比配置为一体的现代化还配备荧光照明的透射光显微镜。基本的光学计划类似于一个传统的偏光显微镜加装专门分光棱镜。甲插入聚光镜之前和之后的物镜的光学路径的偏振器和分析器。(改性渥拉斯顿或利用Nomarski)几个光束分离棱镜设计,以适应具有不同的焦距和光圈尺寸的聚光镜安装在转台组件的物镜,而一个单一的利用Nomarski棱镜(兼容所有物镜式样)驻留在一个滑块帧定位在物镜转换器。这些辅助部件的相对的光的方向和顺序定位也表示在图中。

与相衬,微分干涉对比标本光学路径长度为振幅的差异,可以提高对比度,可视化产生的图像转换梯度。的检体的光程差是由折射率差之间的检体及其周围介质中,经过的光束的光路上的两个点之间的几何距离(厚度)的商品。微分干涉对比显微镜的图像有一个独特的影子投外观,仿佛他们是从一个非常斜的光源从单一方位照亮。不幸的是,这种效果,往往呈现标本中的伪三维浮雕,由不知情的显微镜技术经常被认为是实际地形结构的一个指标。

微分干涉对比显微镜不同于传统的双光束干涉仪器的情况,在很大程度上是一种定性的而非定量的技术。标本进行采样,由两个紧密间隔的部分相干的,但正交的,分隔的波阵面的距离稍稍下方的显微镜的横向分辨率。由于采样光束和参考光束遍历试样类似的区域(和/或周围介质),该密闭空间的间隔距离小于2微米,DIC,因此无法产生精确的测量试样的折射率或厚度。相反,该技术可用于确定相梯度方向,并充分利用物镜光圈超越眼前的焦平面标本功能定位的模糊干扰产生薄的光学部分。

微分干涉对比中采用的波对所产生的来源于钨灯丝的平面偏振的相干光的波阵面的双折射分束器(无论是一个的渥拉斯顿或利用Nomarski化合物棱镜)的动作的前焦面的显微镜聚焦到聚光镜(分束器的位置)。当由分束器产生的一对相干光遇到相位梯度,由于折射率和/或厚度的变化,将成为变形和每条射线在遍历试样时,遇到一个稍微不同的光程差。刚刚从检体时,光线将是不相等的相位。的光程差是翻译由DIC显微镜目镜中观察到在最终图像中的振幅变化成。然而,从简单地检验图像,它是不可能的,以确定是否在试样的相位梯度的折射率或厚度(或两者)的差异的原因。这种不确定性是由于这样的事实:折射率和厚度的产品是来自于光程差,缺乏任一数量的独立的信息,原产地的差异,不能确定。

光束分离棱镜的试样通过相位梯度所产生的波阵面后,通过微分干涉复合第二棱镜和分析器(另一个偏振片)的梯度,得到高对比度的再现。依赖于试样的采样光束和参考光束之间的相位差,振幅变化的基础上产生一个图像的两个微分干涉对比,相位相反的。相衬图像转换从试样衍射光波和参考光束通过聚光镜的环形带,试样和相位板之间表现出的相位变化的振幅信息。DIC图像的区别,但是,对应于数学的一阶导数的大小,从试样得到的光程差的梯度分布,而不是。

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DIC的显微镜的光路中的梯度和强度分布之间的关系示于图2。图2a)中提出的标本是一个环形的人红细胞微分干涉对比与剪切轴由双箭头(西北向东南)表示在高放大倍率成像。的光程差(纵轴)的诗句甲积红细胞的直径沿剪切轴(横轴)是图2b)中所示。需要注意的是光路配置文件反映了薄中心厚边展出人体红细胞。跨微分干涉对比度的图像,非常密切的对应的光程差曲线(图2b)),当添加到一个恒定的一阶导数,在图2c)的强度扫描。正面和负面的道中的红细胞的光路配置文件生成区域的较高和较低的幅度,分别在一阶导数的扫描和相应的微分干涉相衬图像。的光程差分布的区域的,没有表现出的斜率变化为背景,以有相同的强度对应的光程差的一阶导数的积的基线。

微分干涉对比光学配置

战略布局的精确匹配的光学元件(或)共轭附近的飞机和其他的特定位置,于显微镜微分干涉对比(参见图1)的配置方案是必不可少的。所有的主要制造商提供高品质,精密DIC的光学配件,往往在销售工具包,为他们倒正派研究显微镜。在一般情况下,只有四种基本组件都需要配置研究或标准实验室的明视野显微镜观察,微分干涉对比:

· 线性偏振器 -插入到在显微镜光端口(或后的任意位置的照明光源聚光透镜)和聚光透镜组件(参见图1和图3)之间的光学路径中,该组件被设计为产生必要的平面偏振的光干扰的成像。振动面的电矢量分量的透射轴被定向在一个东-西的方向(从右到左,在显微镜前站立时),典型的一个标准的偏光显微镜。某些微分干涉对比设计包括一个旋转偏振器结合为四分之一波长的相位差板,在此位置在显微镜。同时,这些组件被称为一个Sénarmont补偿,并设计用于调节图像的对比度,如随后将要讨论的,以提供更精确的控制。

· 聚光镜渥拉斯顿或利用Nomarski棱镜 -为了分离成两个部分偏振光从偏振片发出的,一个专门的光束分离棱镜(通常称为为聚光镜棱镜)被置于聚光镜光圈光阑孔径的共轭焦点面或其附近的如在图3中示出。事件平面偏振光波前分割(或剪切)到相互垂直正交偏振分量(称为普通非凡的波前)沃拉斯顿棱镜诺马斯基。

· 物镜利用Nomarski棱镜 -后面的物镜位置(图3),可以在一个可调节的滑动框架或固定安装,第二光束分离棱镜采用重组剪切的波阵面的共轭面的物镜后孔径。此组件,这是至关重要的干扰和图像形成的元素,也被称为物镜棱镜。在大多数情况下,在聚光镜物镜焦平面下棱镜的设计和光学特性不同,以确保干涉显微镜孔径平面光学共轭的平面重合。

· 分析仪 -第二线性偏振物镜棱镜后面,通常安装在显微镜物镜转换器之间的中间管和观察(目镜)管。称为一个分析器,该偏振元件位于前管透镜(无限远校正的显微镜)和图像平面(图3)中的光学路径。该分析仪的方向(北-南)的电场矢量垂直于的台下偏振器的透射轴。圆形和椭圆偏振光,通过分析仪和随后到达从物镜棱镜通的组件进行干扰产生DIC图像中间显微镜影像平面(目镜固定膜片或相机系统投影镜头光圈)。

当渥拉斯顿和/或利用Nomarski棱镜从微分干涉显微镜的光学路径中删除,光学配置相当于调整的最大消光(正交偏光)的标准偏振仪器。由于DIC技术依赖于平面偏振光,双折射标本或紧张光学元件,可干扰图像强度,生产未聚焦的明亮区域,否则暗(或黑色)背景。出于这个原因,DIC显微镜的配置应采用无应变的物镜和(优选)聚光透镜元件。标准显微镜物镜通常包含应力签名的镜头坐骑紧张,闭塞和双折射的不均匀性,在镜头产生的玻璃。这些缺陷往往会导致降低的对比度水平,它可以产生严重的后果的最终图像的保真度。此外,分离的波阵面的接近(略小于衍射限制的分辨率)需要高精度的显微镜物镜的规格,特别是在大的放大倍数,为了实现这种技术的能力的完整分辨率。

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3给出了通过一个典型的DIC显微镜的光学列车是一种理想化的主要组件和光路的概略图。透过偏振片射出的局部区域的灯丝通形成直线偏振光方向平行的轴线的相干波阵面由相邻的​​偏光元件(相对于45度的页面的平面)的双箭头所示。渥拉斯顿组合棱镜位于聚光镜上的前焦面的偏振波阵面会聚。

由棱镜(下面讨论),剪切后得到的正交或相互垂直的波阵面被示为一系列的红色双箭头(波前平行于页)点和蓝点(波前垂直于页面)。一旦他们所走过的光路梯度标本中,波前聚集的物镜和收敛后焦平面,第二沃拉斯顿棱镜定位。重组的波阵面,然后穿过第二偏振器(分析仪),其中偏振元件相对于子聚光镜型偏振器(90度)的左侧的黑色双箭头所指示的透射轴的方向与。注意聚光镜棱镜成像到图3中的物镜棱镜,所以,在每一点上的棱晶(相对于彼此反转)沿表面相匹配的波前的剪切。翻译沿剪切轴(垂直于显微镜光轴平行于页,如下面所讨论的)的任一棱镜产生的波阵面的不匹配是均匀的跨显微镜孔径。

沃拉斯顿和诺马斯基棱镜

双折射的沃拉斯顿和/或诺马斯基棱镜插入在光学通路与剪切轴取向成45度角(西北向东南),偏光器和分析仪。两个精密研磨和抛光的板坯生产的高品位的光学石英,单轴双折射晶体楔形棱镜组成的。必须制作两个石英楔具有垂直方向的光轴,以产生一个单一的渥拉斯顿棱镜(或利用Nomarski)。楔形件上面的斜边胶合在一起,以产生光学各向异性的复合板,其中的第一楔形晶体的光轴垂直于光轴的第二楔形。入射的直线偏振光进入棱镜的偏振光以45度的角度,在与光轴取向在聚光镜孔径的波阵面被划分成两个独立的正交波,称为普通特殊的波。

相互垂直的不寻常和普通的组成部分的波阵面是一致的,在相同的方向上具有相同的幅度(70.7%的原来的极化波),以及旅游,通过渥拉斯顿棱镜的下半部分。然而,波以不同的速度传播,由介电性能的低双折射石英结晶楔的沿轴和快轴的定义。普通波通过棱镜所得的快轴方向(具有低的折射率),而通过慢轴,它具有更高的折射率的非寻常光的行进。石英,快轴和慢轴之间的折射率差约为0.6%,和快轴的取向垂直于晶轴的楔形。因此,普通的波穿过石英楔部,而垂直于光轴的方向平行于该轴的异常波。

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胶结石英楔子,剪切角的角度定义为空间上分开的波成为上面的折射率之间的交界处发生的波阵面的角度分割或剪切。在这个边界,普通且平凡的波也交换身份(图4)。一个波阵面(普通)从低折射率的介质传播到较高的折射率的第二介质(上楔块)和弯曲朝向的法线(垂直于的楔子光轴的),根据斯涅耳定律。秒的波阵面(特别)离开高折射率的介质进入的第二介质的折射率低,弯曲的波前相差的正常,但作为第一个波阵面在相同的角度。

剪切角和分离距离是恒定的整个面部的棱镜的所有事件的波阵面,无论的入口点。波阵面的剪切的方向被定义由棱镜剪切轴,在于渥拉斯顿棱镜的平面是平行的光学轴(晶体学)的的石英楔部的下(如图4中所示)。其结果是,将一个进入Wollaston棱镜的偏振波阵面的剪切轴方向平行的方向,而另一种是面向垂直于该轴。剪切角是由棱镜组件的设计(石英楔角,不到一定程度的电弧),并在显微镜中无法调整。然而,剪切距离为分钟(通常小于一个微米),没有可观察到的光束分离发生在从棱镜射出。

在旅途中通过较低的石英楔子在渥拉斯顿棱镜,普通和特殊的波阵面遇到不同的折射率,如上所讨论的。其结果是,在普通的波阵面通过比非凡的波阵面的晶体在一个较高的速度传播。于石英楔子的下限和上限之间的界面的波阵面的交换身份时,普通的波阵面的变成非凡的波阵面的,反之亦然。此外,波阵面时,通过下部和上部的一半的渥拉斯顿棱镜的几何路径是相同的,经过棱镜的下半部分中的相移(由于折射率差),在上半部完全补偿(图b)段)。离中心体验的旅程,通过较长的下棱镜楔前被剪(图4C)),或上楔形剪切后(图4a)),在退出之前穿过棱镜的波阵面。由波阵面扩展的距离通过单棱镜楔最终使波(无论是普通的(图4a)条)或非经常性(图4c))领先于其他到达石英空中接口横向面的棱镜,每单位长度的恒定相移发生在剪切方向上是相等的,但相反的,普通和特殊的波阵面(图4a)和图4c)),一端非凡的波阵面的棱镜,提前出现的普通的波阵面,而在相应的位置上的另一端,普通的波阵面射出棱镜之前的非同寻常的波阵面。

如果剪切轴平行的方向上的渥拉斯顿棱镜的入射偏振光的波阵面,然后正交分裂的波前将不会发生,直线偏振光,会出现从棱镜。同样地,如果入射的偏振光的波阵面的方向垂直于棱镜剪切轴,它也将出现从棱镜相对于取向不变。理想的情况下(和所需的微分干涉显微镜)发生时,入射的偏振光的波阵面以45度的角度的棱镜的剪切轴的取向。电矢量的直线偏振光进入从这个角度一分为二成两个分量矢量,每个振动的快或慢的石英晶体轴线的平面,并具有(70.7%)的根均方原来的波阵面的振幅。两个沃拉斯顿和诺马斯基的棱镜表现出定向依赖特性。准直的线偏振光束,在一个45度角进入对面的棱镜,(这次从顶部)也将产生正交平凡和普通的波阵面。然而,极化波将颠倒过来。

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渥拉斯顿或利用Nomarski棱镜时被夹在两个交叉的偏振器之间,并检查与透射光通过两个偏振器,棱镜,平行与一个主要的中央的黑色带(边缘)(图5中所示),可以观察到的干涉条纹的图案。这些模式的结果之间的斜高亢的普通且平凡的波阵面棱镜的脸出现的干扰。的外围边缘的左侧和右侧的中央暗干涉条纹,显示的经典偏振干涉色谱的日益增加的订单。专为物镜,具有不同的焦距和数值孔径棱镜楔切越来越浅的角度(放大倍率和数值孔径增加)产生较窄的干涉条纹绑扎。图5为一系列的固定利用Nomarski棱镜设计的连续的较高的物镜的放大倍数(图中所示)上的右手侧示出这个概念。

如果一阶补偿器(红板)被添加到在对角位置(图5中未示出)的交叉偏振器夹心,被替换为黑色条纹表示减法(黄色)在一边和另外(蓝色的干涉色)原来的暗条纹的位置的另一侧。添加的第二沃拉斯顿或利用Nomarski棱镜顶部的第一相移补偿(以及由此产生的干涉条纹)的第一棱镜的整个长度上,导致消光(如图5中所示,注意才能观察到,这种影响,如果实验有两个棱镜相同的剪切角)。翻译棱镜相对于其他横向均匀的偏置,或路径长度的变化,将被引入,可以观察到(图5)通过三明治。在一个方向上滑动棱镜将变暗,然后减轻棱镜,在另一个方向上滑动的同时,将产生一系列均匀的干涉色(从黄色一阶)。

夹在两个偏振器之间利用Nomarski棱镜观察到的干涉条纹出现浮在空间上方几毫米,棱镜。然而,当相同的条纹被视为使用Wollaston棱镜,它们似乎在于内部的棱镜。利用Nomarski和渥拉斯顿棱镜的干涉条纹的位置被称为干涉平面。因为在传统的渥拉斯顿棱镜的干涉平面被定位在棱镜的中央部,在约中心线之间的楔形件(图6),它是难以适应沃拉斯顿棱镜的使用与标准的显微镜物镜。该问题是因为棱镜的干涉平面必须一致,并且重叠的后侧焦点面(也称为衍射面)的物镜,这往往在于以下的玻璃透镜元件的内螺纹安装。

大多数制造商规避的物镜孔径间隙问题通过采用诺马斯基(偶尔被称为改性沃拉斯顿)棱镜聚光镜物镜焦平面梁剪切和重组的职责,分别。由于一个专门设计的,如下面所讨论的,利用Nomarski棱镜的干涉平面位移到一个站点以外的棱镜,而不是在传统的沃拉斯顿设计的楔形元件跨越几个毫米。利用Nomarski棱镜不要求物理上位于物镜聚光镜焦平面,但可以定位一些距离。利用Nomarski棱镜虽然不产生更好的对比度,它们避免了潜在的问题,干涉条纹变得不可见视。应该指出的是徕卡显微一旦产生一种流行的显微镜被称为史密斯的T微分干涉对比系统,其中纳入标准的渥拉斯顿棱镜到特别设计的物镜。然而,这样的设计策略是罕见的例外,而不是规则。

利用Nomarski棱镜,像一个Wollaston棱镜,由胶合在一起为斜边的两个光学石英楔子。楔常规渥拉斯顿石英楔子是相同的,并具有的光轴取向平行于棱镜表面。然而,修改的第二楔形切割石英晶体,以这样的方式相对于平坦面的棱镜的光轴倾斜的方向。当楔块相结合,形成复合棱镜的双折射,在焦平面(和干涉条纹的产生当偏振光通过棱镜时)之外的棱镜板中,如上所述,如图6所示。产生这种情况的,因为现在的剪切发生在空气 石英界面的下楔块,石英楔之间的界面处的折射导致剪切的波阵面的衔接交叉点以外的棱镜。利用Nomarski棱镜焦平面的实际位置可以调整超过几个毫米的范围内,通过改变在第二石英楔子用来构造棱镜的光轴的倾斜角度。

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尽管利用Nomarski棱镜广泛为物镜棱镜,在现代微分干涉相衬显微镜,有较少的电容式棱镜的空间的限制,而这往往是孔径平面内精确定位。因此,常规的渥拉斯顿棱镜有时可以被插入显微镜聚光镜,但在许多情况下,利用Nomarski棱镜代替。在聚光镜中被利用时,利用Nomarski棱镜,棱镜的设计,以产生干涉平面位于更接近于棱镜比用于与物镜构成。其结果是,除了被安装在具有不同几何形状的帧,利用Nomarski棱镜发现在现代DIC显微镜不同的被切断,并且是不可互换的。总之,对于微分干涉显微镜,聚光镜棱镜(也称为作为次要的辅助补偿的复合棱镜)作为一个主剪切分束器的偏振波阵面的物镜棱镜(主体棱镜),而重组的分离波和调节的程度低下之间的平凡和不平凡的波阵面。

重要的是要记住,对准显微镜科勒照明是一个重要和必要的步骤,以确保正确的定位,利用Nomarski棱镜干涉平面与聚光镜物镜的共轭孔径平面重合。中央,或零阶的干涉条纹,这是观察时,利用Nomarski棱镜被放置在交叉的偏振器(如上面所述),可以用于在显微镜的取向,以确定正确的方向的棱镜。

DIC波前关系和图像形成

从所述聚光镜的渥拉斯顿或利用Nomarski棱镜的孔径平面出现后,剪切的普通和特殊的相干波阵面聚焦透镜元件的检体之前,由物镜收集聚光镜和穿越。沿着它们的轨迹在聚光镜物镜之间保持相互平行地,波阵面分离由来自聚光棱镜的几何约束进行的剪切距离。波阵面(剪切的距离)之间的空间距离随聚光镜和物镜的数值孔径,但现在在0.11.5微米之间的实际的限制,被设计为稍小于(或等于在某些情况下)的横向分辨率的线性范围的物镜。微分干涉对比分辨率可以增加(在对比度为代价的)通过减少剪切距离大约一半的物镜的最大分辨率。

大多数显微镜制造商上的剪切与距离分辨率和对比度权衡妥协,产生棱镜有一个最大的剪切距离约0.6微米较低倍物镜(10倍)下降到最低接近0.15微米的高倍率物镜(60X100X)。不管剪切距离,然而,重要的是要注意,紧密间隔的波阵面的对,空间上分布在整个显微镜的光圈,样品试样的每一个点在图像平面上的双光束干涉,以最终提供。

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当受到检体的存在下,相干波前对遇到相同的试样和图像平面之间的光程差,到达物镜的后侧焦点面,具有相同相位的关系,当他们离开聚光镜。利用Nomarski棱镜位于后面的物镜重组的波阵面在物镜的焦平面,以产生具有台下偏振器的透射轴相同的方向电矢量振动的直线偏振光。阻止通过第二偏振片(或分析仪)的偏振器(图7a)和图7b)),它具有一个透射轴取向垂直于退出物镜棱镜的线性偏振的波阵面。其结果是,出现在视场中观察到的图像的背景很暗或黑,简称为消光的条件。

没有试样引起的相移,聚光棱镜的光束分离动作的精确匹配,逆转的物镜利用Nomarski棱镜最终产生直线偏振光束重组效果。换句话说,当在显微镜科勒照明(高分辨率微分干涉显微镜的重要先决条件)而正确的配置,聚光镜物镜的协同运行,投射图像到物镜棱镜的光源和聚光棱镜。物镜利用Nomarski棱镜,方向反转相对于聚光镜棱镜,介绍了精确地补偿由聚光棱镜产生的波阵面之间的非线性相移的相移。这个动作发生的所有配对的波阵面在整个显微镜光圈。聚光镜物镜棱镜的轴以45度角度的交叉的偏振器(偏振器和分析器)的透射轴相对于彼此的取向为平行。两个棱镜的取向轴的被称为剪切轴,一个重要的概念,定义的时候,他们离开聚光棱镜的普通和特殊的波阵面的轴线之间的横向间隔,直到它们被由物镜棱镜复合到达图像平面。

波前畸变在发生相干成对的波阵面遇到标本中存在的相位梯度,而通过从聚光镜物镜,被诱导的波将经过沿剪切方向的相移,并遍历稍微不同的光路(虽然没有变化极化而发生)。当到达物镜棱镜,相移成对的波阵面被重新组合,以产生椭圆偏振光(在相反的直线偏振光,在没有制作的标本)。电位移矢量所得到的波阵面,而不再是平面的,扫出一个椭圆形的通路,因为它穿越的物镜棱镜和分析仪(图7c)中示出)之间的区域。因为分析仪的透射轴平行的椭圆形的波阵面的一个组成部分,通过分析仪的波的某些部分,并产生具有有限的幅度和最终能够产生图像平面中的强度的平面偏振光。

总之,试样中的光路梯度引起的相移,在配对的相干波阵面的剪切由聚光棱镜,通过对平行的轨迹。这些相移被翻译成由物镜利用Nomarski棱镜的相位差,创建椭圆偏振光,是能够通过线性成分通过分析器创建映像。事实上,在整个试样字段,创建的相位梯度的存在或不存在线性和椭圆偏振的波阵面,有选择地通过其振动平面的方位角的分析装置的组合。可以通过分析仪的波阵面都是平面平行的,并可以产生一个试样的振幅图像,通过在图像平面上的干扰。当物镜棱镜精确地补偿聚光镜棱镜(因为它在科勒照明)的影响,分析仪块的波阵面在源自该字段的所有空间位置的缺乏(没有检体相的梯度)的相移。由此产生的背景是暗视场观察(参展总灭绝)的异常陡峭标本折射率或厚度梯度,这似乎更亮(通常以大纲形式)的区域显示。形象出现的经典,简单,暗场照明技术所产生的图像非常相似。

这些概念被描绘在图8中,其中提出后通过相试样(具有较高的折射率比周围介质中),和它们相应的振幅(或强度)的配置文件在图像平面的剪切波阵面之间的相位关系的图形。相互垂直的波阵面(标记为Σ(1Σ(2) ,请参阅图8a)),通过试样的扭曲,并显示局部区域的相位延迟(称为差分相位延迟)。的物镜利用Nomarski棱镜重组取消引入由聚光棱镜的角波剪切的波前的波前变形的过程中产生的横向位移。波前畸变型材(平凡和普通的组件)在图像平面重建沿剪切轴线的说明在图8a)在双棱镜仪器配置已经调整到最大的灭绝。试样引入的波阵面的相位延迟(φ)表示的剪切轴(x)的浸沿的宽度,而在纵坐标上(以纳米为单位)表示放大的试样直径(在这种情况下,一个单一的液滴的油状物)。

dic intro figure8

在图8a)的波阵面的相位滞后后已发送通过分析器团聚在图像平面和相消干涉,由此产生的强度分布沿剪切方向(图8的振幅积可以表示为( b)段)。对于本例中考虑对称的油滴标本,作为剪切轴之间的距离的函数的振幅的积产生暗的两侧是明亮的区域(参见图8b))的中心空腔。数字图像的实际标本在显微镜下观察(图8C))显示明亮的边缘叠加在黑色的背景和暗干涉条纹带中心的球形微。图8中的图像被记录在一个直立显微镜光学系统的配置与DIC。倒立组织培养显微镜产生基本相同的结果,但是,中央干涉条纹二等分的半球状的油滴将定向为垂直于图图8c)中所示的那些。

介绍偏置迟缓的

调整最大的灭绝在微分干涉对比显微镜,视场呈现一片漆黑,几乎是黑色的,背景,表现出非常高的灵敏度标本地区,同时具有增加和减少相梯度。图图8c)中所示,一些标本细节模糊或非常困难的,以解决在此配置中,可以遍历突出的特点,常常可以观察到的干涉条纹的零级。在实践中,物镜利用Nomarski棱镜沿剪切轴的横向偏移量,均匀地转移通过试样的普通和特殊的波阵面的相对的相位位移。因此,从物镜棱镜出现的光的偏振矢量方向可以调整,从线性到各种程度的椭圆形,甚至圆形。相对于普通的波阵面的相位移的转移的非凡的波阵面通过翻译的物镜棱镜通常被称为偏置相位差DIC的显微镜的介绍

物镜利用Nomarski棱镜横向移动(或者左侧或右侧的显微镜的光学轴),波前对背景越来越滞后的相位与相对于彼此。其结果是,在进入分析仪的波阵面的椭圆偏振的程度增加,背景强度逐步转换从黑到介质和较轻的灰色阴影。此外,引入的偏置相位差的变化的零级干涉条纹的位置,并产生相应的变化,在该样本中的相位梯度的强度水平。这些取向依赖目前较亮的背景颜色通常被称为零阶灰度明亮的区域和黑暗的阴影叠加产生的结果。最终DIC图像不依赖于被引入完全通过翻译的物镜棱镜的光程差,并沿显微镜光轴聚光棱镜时,可以得到相同的结果。然而,在大多数仪器,它是更为方便的产生偏置相位差,通过移动的物镜的位置,而不是安装在聚光镜中的炮塔的棱镜的棱镜。

通过改变偏置相位差引入到试样发生亮度梯度沿剪切轴的聚光镜物镜棱镜,一般出现源自以45度角(西北部到东南或反之亦然)时,观察到的试样目镜(参见图8f)条)。请注意,在图8中所示的梯度(六)被记录,与一个正立显微镜。倒置显微镜生产强度梯度,面向垂直直立显微镜中观察到的那些。在一个方向或另一个会影响干涉条纹偏移和改变普通和非凡的波阵面之间的相位关系(智障或高级),从而扭转了阴影投在试样方向移动棱镜。

引入偏置相位差的净结果是使试样在伪三维浮雕图像增加光程差(倾斜的相位梯度)的区域出现明亮的(或暗),和那些表现出路径长度减小出现在反向。试样的功能出现类似的高原升高或凹陷的凹部,根据相位梯度方向,这是一个显着特征的微分干涉对比。然而,三维外观只对应相梯度,不应该被混淆与实际试样的几何形状(如过于频繁的情况下)。在某些情况下,实际的地形特征也是不断变化的相位梯度的网站,但作为独立的调查的结果,获得的信息的情况下,这个事实不应假定。

在微分干涉显微镜的偏置相位差简介图图8d)中示出通过图8f)就组成的多个半球状的油滴的相位标本。当在显微镜调整最大消光,显示普通和特殊的波阵面沿剪切方向的相移,但不表现出背景的对应的区域(图8a))的相位差。翻译的物镜棱镜的偏置相位差此外一个波阵面之间的相对相位移位相对于其他的(图图8d)),但保持相同的波阵面的剪切。干扰的像面,产生的振幅(或强度)的积,作为剪切距离的函数(图图8e))后,显示一个明亮的边缘区域的一侧上的油滴和暗区域的相对侧上。在显微镜中观察时,试样显示出阴影铸态的外观,就好像它是从一个高度倾斜的角度(参见图8(六))照射。为了观察最大消光之间的差别,除了偏置相位差,比较试样图像呈现在图图8c)及(f)。的阴影的方向,这是依赖于剪切轴(图8中的(c)和(f)段),在相反的方向上按相同的量的物镜棱镜翻译可以扭转的双头箭头。

偏置已翻译物镜利用Nomarski棱镜沿着光轴来回使用微调旋钮位于端的安装框(通常放置在显微镜的物镜转换器壳体或中间管)引入传统的微分干涉差显微镜。一种替代技术,这是日益深入人心,是四分之一波长相位差板的安装在固定的方向之间的偏光器和聚光镜的棱柱(称为Sénarmont DIC补偿)。最大消光,相位差板的快轴与偏振器的透射轴对齐,两个光学单元可以是(往往都是)的基础上,在显微镜的同一壳体内包含。去Sénarmont补偿器的备用位置,在显微镜配备适当的中间管的物镜棱镜和分析仪之间。

为了使引入的偏置使用去Sénarmont补偿器,偏振器的透射轴旋转(加或减45度)的相位差板,保持固定在一个90度角相对于分析仪的快轴相对于传输轴。当补偿器的快轴相一致(平行)与偏振器的透射轴,只有直线偏振光通过通过去Sénarmont补偿器的聚光棱镜。但是,当偏振器的透射轴旋转时,从四分之一波长的相位差板的过程中出现的波阵面成为椭圆偏振光。旋转偏振器在一个方向上会产生右撇子的椭圆偏振光,旋转的同时在另一个方向上的偏振器将改变矢量轨迹生成一个左手系的椭圆扫描。

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当起偏器的透射轴的方向达到无论是加或减45度(相等于四分之一波长的相位差),补偿器的光通过圆偏振光(再次在任何一个惯用左手或右手的意义上)。因为椭圆或圆偏振光代表的普通和特殊的新兴的从去Sénarmont补偿的波阵面之间的相位差,偏置引入到系统的波前进入聚光镜棱镜和剪切。正偏压时,得到的偏振片在一个方向上旋转,而通过在相反的方向旋转偏振器引入负偏压。

不管偏置是否被引入到翻译的物镜利用Nomarski棱镜或旋转的偏振片上解Sénarmont补偿由一个微分干涉对比系统,最终结果是相同的。正如前面讨论的,在一个正确配置的显微镜,科勒照明,图像的光源和聚光棱镜是由光学系统(聚光镜物镜)转移到位于上面的物镜的后侧焦点面倒立的第二利用Nomarski棱镜对准。整个面部的聚光棱镜的线性相移被精确地补偿由一个相反的相移在物镜棱镜。翻译的物镜棱镜沿剪切方向不改变的相移分布,而是,添加或减去一个恒定的相位差在整个显微镜的光圈。旋转在去Sénarmont补偿偏振器中相同的方式,还引入了一个变量,并控制相位差。匹配的棱镜系统使图像形成发生与每一个波前对投影来自聚光镜的孔径相同的偏置电压的相位差,不论路由通过它穿过试样到达物镜

如图9所示的是一系列的数字图像记录在DIC使用偏置在一些中间步骤中的二十分之一到四分之一波长的相位差范围。样品是15微米边的固定和安装小鼠小肠包含波动厚度的区域。的试样细节和阴影铸的伪三维效果是最显着的在较低的偏置相位差值(图9a)和图9b)),但细标本细节的对比度和清晰度都恶化,作为偏置相位差的移交增加(图9c)到9f)条)。在偏置迟缓最高值(四分之一波长;9F)),对比度极差,极少数的结构细节可见。对于这个特殊的试样,最佳相位差范围介于的二十分之一的波长的十二分之一。

作为光路梯度增加的标本,因此图像对比度。改变偏置相位差在不同程度上也可以产生显着的对比目镜(图9)中所观察到的试样中的波动。在一般情况下,诱导的翻译的物镜棱镜,或通过旋转在去Sénarmont补偿偏振器之间的普通和特殊的波阵面的位移,是最佳的程度上的顺序小于十分之一波长。但是,该值是在很大程度上依赖于试样的厚度,有用的范围的生物样本的偏置相位差之间的三十分之一和四分之一波长。对比标本中具有非常大的光学梯度往往可以受益于更大的偏置相位差值(全波长)。成一个微分干涉对比显微镜使偏置迟缓阶段更容易被观察的标本,并与传统的胶片或数码相机系统,极大地方便了成像努力。

DIC显微镜补偿迟缓板

偏置微分干涉对比普通和特殊的波阵面之间的相位差,也可以通过使用最初的物镜作为定量的相位差测量装置和偏振光显微镜的对比增强元素的补偿操作。补偿板赋予更大的控制,用于调整试样的细节的对比度有关的背景强度和颜色值中,并且也能够更精确地调整的波阵面之间的偏差值。这些双折射元件也经常采用的光学透明的标本的染色,通常呈现在有限范围内的灰度值。

当一个标准的物镜利用Nomarski棱镜翻译显微镜沿光轴的四分之一波长,这两种试样的功能,并获得一个频谱牛顿干涉色偏振光显微镜中观察到的相似的背景之外的路径差。试样和背景的颜色过渡,通过一系列的灰度值,通过白色,黄色,红色,蓝色和高阶迁移变得光染色。光学染色产生的戏剧性和精美的彩色图片,但对科学应用的用途有限。通常情况下,最佳的标本的对比被限制到二十分之一到四分之一波长的相位差的范围内。

补偿器可以插入到物镜棱镜和分析仪或偏振器和聚光镜棱镜之间的DIC显微镜的光学路径。许多显微镜在中间管或为此物镜而设计的台下聚光器壳体有一个插槽。另外的一阶补偿器(通常称为全波一阶的红色板)具有等于全波长的可见光(约550纳米),绿色区域中的延迟值,引入了频谱的干涉色检体和背景。与补偿器代替,绿色光无法通过分析仪,因为它从与偏振器的电场矢量具有相同的方向的线偏振光的相位差板。然而,在红色和蓝色光谱区域的波阵面发生相位差小于一个波长,成为椭圆偏振光,使他们能够通过分析器传递组件。其结果是,这些颜色混合形成的视场中的品红色的背景。

因此,当试样中观察到的白色光微分干涉对比光学系统和一阶补偿,背景显示品红色,而在将显示在二阶的蓝色和黄色的颜色的一阶(视方向而定)的图像的对比度牛顿干涉色谱。补偿到位的翻译诺马斯基棱镜(或旋转偏光镜在一个Sénarmont补偿),具有大光学相位梯度结构中观察到的干涉色产生快速变化,小的变化获得偏置迟缓的。这种技术是有用的颜色(光染色)引进具有高折射率的界限,如细胞膜,细胞内颗粒大,纤毛和细胞核的地区。标本功能显示的干涉色,可以比较在米歇尔征收的比色图表获得的估计值的光程差的值。

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在图10中示出几个透明的标本已光学染色,呈现在伪三维浮雕通过DIC的光学技术。图10a)示出口的犬钩虫(犬钩虫),而图10b)的特点是在突起的边缘处的栉鱼鳞。图10(三)大,豹纹蛾(Ecpantheria scribonia)的七彩翅膀上的鳞片。在所有情况下,利用Nomarski棱镜被翻译通过显微镜光轴的偏置相位差值,该值超过全波长。虽然这些图像不显示隐藏的科学信息有关的标本,他们这样做有可能提前DIC的光学显微镜技术,作为一个合法的科学和艺术之间的桥梁。

开成一个微分干涉对比光学系统引入偏置与解Sénarmont补偿显微镜配备一个全波的相位差板可以被添加到光学染色试样与牛顿的干涉色,并提供更多的定量信息的路径差。如上所述,Sénarmont补偿经常采用DIC的显微镜取得的偏置相位差的精确测量的水平,但该设备也是有用的,监视对应的光学组件。在视频的增强型DIC的显微镜,去Sénarmont补偿往往利用优化对比度标本细节在于显微镜的分辨率极限以下。

DIC图像的解释

其中最显着和广受认可的微分干涉对比显微镜获得的图像方面是高度可见的浮雕,表现通过赋予伪三维写实的阴影投效果。在一般情况下,标本出现,通过光从低角度与高度倾斜的光源,让人联想得到的结果与传统的斜照明或霍夫曼调制对比。然而,谨慎,图像应始终被解释与理解的阴影和高光的影子投引渡相或光学路径渐变指示标志和坡向,不一定透露精确的几何或地形参数。

从观察在几乎每一个产生的图像通过偏置相位差的阴影铸造定向本,光学剪切方向是明显的,可以精确地定义为显示的最高和最低亮度值的区域的轴线连接。应考虑的另一个考虑因素是检体之间的关系及其周围介质中,因为阴影的方向通常相反试样具有较高或较低的折射率比周围的详细信息。其结果,致密的亚细胞颗粒,如细胞核,核仁,线粒体,细丝,中期染色体,,溶酶体通常显示提出的海拔(小山顶)的外观,而较低折射率的夹杂物(例如,吞饮小泡,水空泡,脂滴)似乎是凹陷的凹部(凹)。

检体相梯度(伪立体感的程度)的微分干涉对比赋予的对比度电平是翻译诺马斯基棱镜或旋转偏振器去Sénarmont中的,由该光学系统引入的量的偏置相位差的函数补偿器。因为利用Nomarski和渥拉斯顿棱镜的设计和其他约束涉及微分干涉对比的波阵面取向的剪切轴是固定的,不能被改变的轴线方向上影响标本的对比,通过一个简单的显微镜上的设置。然而,普通和非凡的波阵面之间的相对相位延迟是可以逆转的搬迁物镜棱镜,从一个侧面显微镜的光学轴(偏置迟缓转移由负转正,或反之亦然)。此操作也可以通过旋转偏振器上去Sénarmont的补偿器的相应的负值。当相位延迟被改变如刚才所述,在试样上的亮区和暗边的方向扭转180度。在本质上,可改变相对于试样的剪切轴的显微镜的唯一机制是为调整试样本身的一种手段,有利于从圆形360度可旋转的阶段(设计主要是为偏光显微镜)的利用率。

在微分干涉对比度的图像,阴影和高光强度是最大的沿剪切轴的显微镜,和恒定的折射率的显示亮度值是相同的背景区域的。当检查的试样具有球形的几何形状(图8f)条)从几个方位接壤的背景边缘的对比度,它被发现是最小的对比度区域中垂直于剪切轴。事实上,试样和背景之间的对比度差异逐渐减小,直到他们到达定义的零级干涉条纹(垂直于剪切轴)的轴线的方向中的最小值。在图8c)和图8f)中的试样表现出最低级的对比度(无标签的白色箭头指示的)的区域,在中心区的边缘正好垂直于剪切轴的油滴。为了验证这个概念,比较干涉条纹满足的背景图像中的记录,可在最大消光(图8c)条)的偏置相位差引入后生成的图像中的相应区域的边缘(图8f) )。无标签的白色箭头标记的区域,普通和特殊的波前畸变对齐的配置文件,减去取消剩余迟缓和屈服强度值完全匹配的背景分析仪。

在微分干涉显微镜检查每个试样将有一个最佳的偏置相位差设定在最终图像中产生最大的对比度水平。非常薄的试样显示一个浅的折射率梯度,如活细胞的培养,一般可使用同样低的偏置设置仅稍大于最大的相移标本中存在(约一个波长的二十分之一的顺序,或约30纳米)。然而,较厚的标本往往需要较高的偏置设置(四分之一波长)大型聚光镜孔产生令人满意的结果,通常是通过光学切片。因为许多试样组成的功能,显示的各种不同的尺寸和折射率,最佳偏置相位差设置通常是一种妥协。

方位角微分干涉对比一些试样的取向现象的影响列于图11。在所有情况下,剪切轴指向西北向东南,但并不表示对个人的数字图像。图11a)和11b)示出的毛孔及皮纹所表现出的安装来自硅藻布纹attenuatum frustule周期间距。当长轴的frustule的取向垂直于剪切轴(图图11a)),毛孔合并成一系列紧密间隔的脊,单独都没有解决。与此相反中,剪切轴平行的方向上重新定位frustule揭示的旋钮状的几何形状的孔结构在这样的物种。

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含鳃排骨淡水水蚤(水蚤),图11(三)胸部区域。在该取向中,各个肋结构都清晰可见(垂直于剪切轴线),并连接到一个共同的脊椎,显示为剪切轴线平行的一长系列的旋钮。当试样旋转90度(图第11d)),许多肋结构失去对比度,脊髓旋钮合并成一个单一的脊。最后,夹杂物在栉鱼鳞缺乏对比度和叠加在纹状体棘(图11E))时,很难区分。试样的旋转带来的的棘平行剪切轴(图11f)条),它们的对比度降低,使夹杂物清晰可见。

许多因素时,应考虑调整偏置迟缓,产生最佳标本的对比。水平偏差,必须引入最大限度地变暗一个斜坡或试样边缘也产生最大可能的试样和背景之间的对比度。因此,对于每一个标本,一个特定的物镜棱镜(或取消Sénarmont的补偿器)设置通常会引入最大程度的对比。超过此值时,对比度会降低。较厚的标本,经常遭受来自光散射文物,通常需要一个更大的偏置迟缓设置(全波长)比薄的标本获得具有显着的阶段梯度地区灭绝。最后,当在聚光镜中的可变光阑开口尺寸超过75%的物镜后孔,减少过多的在光学系统中的光散射的结果对比。随着这个困难时,请小心打开聚光镜光圈以执行光学切片实验。

光学切片

大型聚光镜和物镜的数值孔径的微分干涉对比标本图像的能力,能够创造显着的浅光从一个集中的图像部分。如果没有光晕和侧面去掉从焦点从明亮区域分散注意力的强度波动的干扰,该技术得到锐利的图像,都整齐地从复杂的三维相位标本切片。此属性通常利用取得清晰的轮廓,在复杂的组织细胞的光学部分的焦平面上的上方和下方的结构以最小的干扰。

在所有传统形式的透射和反射的光镜,孔径光阑聚光镜发挥了重要作用,定义图像的对比度和分辨率。产生增强的对比度的同时,减小光圈的大小字段和整体图像的清晰度增加了深度。但是,如果隔膜被关闭太多,衍射工件变得清楚和分辨率牺牲。通常情况下,最佳的光圈设置是准确地渲染足够的对比度和保留图像分钟功能需要的分辨率,而避免衍射文物的标本细节之间的一种折衷。

高性能的微分干涉差显微镜的光学系统与聚光镜部分闭合的可变光阑(约70%的物镜后的光圈大小)产生优异的对比度,而且还当膜片被打开以与物镜孔径大小相匹配性能极佳。为了实现光学切片分辨率和对比度之间的最佳平衡,必须正确地配置在显微镜科勒照明棱镜元件和偏振器应精确对准。高数值孔径物镜设计用于浸油只应利用图像试样滑动到聚光镜的底部的油。

在高放大倍率和数值孔径(例如,100倍和1.4),微分干涉对比景深接近一个限制值,约400纳米(0.40微米,约1.5倍的横向分辨率极限的物镜)。通过一个人口腔上皮细胞在高放大倍率(100倍物镜)和数值孔径(1.30)的中央区域所拍摄的图12中所示的光学部分。该单元格是约3微米厚的附近的细胞核中,利用取得的图像在图12中为约0.5微米的配置和景深。细菌是清晰可见的单元格(图12a))的上表面上,是平行的,在膜旋转脊非常相似的手感的人的指纹。甲隆起对应于细胞核膜在较低的中央部的图中也可看到。当焦平面被转移到细胞内部(图12b)条),核结构和细胞内颗粒变得可见。最后,在细胞膜放在显微镜载片上的表面(图图12c))的下边界,揭示许多折叠脊(的上表面上所观察到的相似)。

dic intro figure12

当执行用较厚的生物标本(特别是那些在水溶液中的盐溶液浸渍)的光学切片实验时,必须警惕的显微镜盖玻片和安装介质之间的界面处的折射率不连续所产生的球面像差的可能引入。这些项目将降低分辨率的光学部分系列更高的穿透深度。

当前甲显着量的微分干涉对比理论的研究和开发集中在引人注物镜光学切片的技术特征。最终,从标本的三维折射率分布图的定量估计,可以实现通过计算模型。此外,目前的研究还冲着新车型正在开发的部分相干的透射光DI​​C的光学元件和图像形成。

结论

微分干涉显微镜基本上是作微小的,一般的艾里斑的直径稍小于剪切系统,在该系统中,将参考光束的光束剪切干涉。事实上,在该样本中的每一个点所代表的两个重叠的在最终图像中,一个明亮,其他比背景暗的艾里磁盘。基本的显微镜系统,首先由Francis史密斯1955设计,是修改后的两个渥拉斯顿棱镜附加的,一个聚光镜的前焦面和第二物镜的后焦平面的偏光显微镜。

后来的修改,建议由乔治利用Nomarski,使棱镜相差的光学孔径共轭平面在物理上位于。聚光镜棱镜将每个成两个稍微移位,相对于彼此是正交偏振的平行光束,照射试样,而物镜棱镜用于重新组合的光束的波阵面。镜像到另一个由光学系统,这两个棱镜的组合,是在高数值孔径的微分干涉对比,以形成锐利的图像的能力的一个重要特征。

用梯度的几何路径长度或试样的折射率,这会导致在椭圆偏振光的合成光,退出物镜Wollaston棱镜被引入到两个正交波阵面的相位差。偏置相位差可以被引入到系统翻译的物镜棱镜沿显微镜光轴或通过四分之一波长板的偏振器或分析仪相结合。因此,通过简单的旋转控制旋钮,可以得到最佳的对比度,场亮度和灵敏度。

由此产生的DIC图像具有阴影铸态的外观,有效地显示为低和高的空间频率的光学路径的梯度。这些试样的光路的区域增加沿基准方向显得更亮(或暗)的区域出现在路径差减少,而以相反的对比度。陡峭的梯度光程差导致较大的反差。各种各样的标本与微分干涉相衬成像是很好的候选人,包括非常薄的细丝或尖锐的接口,从而产生良好的对比度,甚至当他们的直径低于光学系统的分辨率极限。

其中主要的微分干涉对比显微镜的成像优势是较小的标本特征的形象,不像暗场或相衬,没有遮挡相邻的地区,具有较大的光学梯度。此外,中性灰色的背景上显示的图像的阴影铸造,耦合到成像非常小的特征,连同那些大得多的灵敏度(例如,分钟附属物活细胞或动态的夹杂物在细胞内的细胞器和移动)传统相衬技术是一个重大改进。这些好处,除了对比度控制宽动态范围和浅景深,都促成了该技术的广泛普及。

对比度在DIC的显微镜是有方向性的,表现出最大沿剪切的轴线和在正交方向最少。艾里斑分离(平均峰-峰的分离磁盘半径的二分之一到三分之二)的方向与剪切轴的显微镜,它是最大对比度的方向相一致。其结果是,DIC对比度传递函数(CTF)也是方向沿着剪切轴。通过试样的两个波阵面之间的横向位移大约一半的物镜的分辨率极限。这种小程度的剪切力,诱导,由渥拉斯顿或利用Nomarski棱镜类似的行动,一个高通滤波器的空间频率的对比度细节在试样。相应的调制传递函数(MTF)紧跟在明照明的高空间频率观察,但样品的功能,超过几个微米大小(空间频率较低)显示急剧下降。

适合在DIC的观察标本包括液涂片检查,活细胞培养物,血细胞,亚细胞器,未染色的组织,染色体,原生动物,胚胎,硅藻,聚合物,副本,以及比较厚的超薄切片。更多信息可以通过检查振幅和相位幅度混合标本,如天然色素原生生物,藻类和淡染的组织学标本。该技术通常是组合使用,以显示细胞形态与荧光区域荧光显微镜。当耦合增强的视频技术(称为VEC-DIC视频增强的对比度微分干涉对比),DIC可以被用来产生结构,具有以下的尺寸的显微镜的光学分辨率的图像。