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尼康显微镜:CCD成像基本原理

2013-10-16  发布者:admin 

显微摄影的主要媒介,在过去的50年里,一直是电影,曾在科学界以及无数忠实地再现图像从光学显微镜。它只有在过去十年中,在电子相机和电脑技术的改进已经使数字成像更便宜和更容易使用,比传统摄影。

digital eclipse

在图1所示的是一个尼康Eclipse 600传输/反射光显微镜配备售后市场的珀耳帖冷却的数码相机能够在一个较长的累积期间整合图像。的照相机系统的控制由一个单独的单元,其容纳在一个IBM兼容个人计算机的FireWire端口的接口。整合期间和其他图像采集参数选择由专用的基于Windows的软件程序。

 

当相机具有电荷耦合器件(CCD)成像传感器集成在传感器上或非常接近的模拟至数字(A / D)转换器,它一般被称为作为数码相机。由于CCD芯片,像所有的光学传感器,模拟设备产生的电压不同的流,数字一词仅用于当那些在计算机兼容格式在相机和输出电压进行数字化处理。在一个12位的数码相机中,从CCD的模拟信号被数字化,由板上的A / D转换器具有12位深度。与否的输出实际上可以被分解为4096个离散的强度水平(12位)取决于相机上的噪声。为了区分个人之间的强度等级,每个灰度级的步骤应该是大于约2.7倍的相机噪声。否则,步骤29822983之间的差异,例如,不能得到解决的任何程度的确定性。一些所谓的12位相机有这么多的相机噪音不能受到歧视,4096个离散的步骤。

 

如果开始的是模拟信号,数字化过程中的相机,而不是下游某处为什么?使用相机的A / D转换器有两个好处:减少噪音和计算机兼容直接输出。一般情况下,越接近A / D转换是到传感器时,噪声电平越低。从CCD的低层次的模拟信号噪声比他们高层次的数字更为容易损坏。在理想情况下,在A / DCCD芯片上,紧邻的传感器的输出放大器。噪声越低,更多的灰度级可以被识别,因此,可以被有效用于强度测量的位数越多。

ccd group

数码相机的模拟对应的几个优点。数码相机产生不同于摄像机的隔行扫描信号生成逐行扫描输出。需要专门的隔行扫描视频信号的数字化采集板和帧缓冲区。逐行扫描摄像机的输出可以直接连接到计算机(例如,IEEE-1394RS-422SCSI接口)。在逐行扫描相机,整个图像的曝光时间(也表示为整合期)期间首次收购,然后读出,线线从顶部底部的图像。现代高速放大器和A / D转换器,允许数码相机全帧图像的速度等于或超过视频帧速率。

 

数码相机的另一个优点是,输出完全适合在计算机显示器的格式。由于信号已经数字化,图像存储,处理和显示,大大简化了类似的演习相比,使用视频信号。数码摄影照片,幻灯片和底片的处理中被淘汰的困难,因为现在许多科学期刊接受的数字图像文件。其结果是提高质量公布的图像中显示的演示。数字化图像处理,压缩,通过网络传播,粘贴到文档中,或调整成一张海报。

 

CCD架构

两个CCD数码相机设计中常用的隔行传输和帧传输。的行间传输CCD采用电荷转移通道,每个光电二极管的旁边,使得所累积的电荷可以是有效地和快速地交给他们的移位器(图2)。隔行传输传感器也可以被电子关门倾倒所存储的电荷,而不是转移到传输信道由。帧转移CCD采用由两部分组成的传感器,其中的上半部分是由一个不透光的掩膜覆盖,并用作存储区域。光被允许落在露天部分,所积累的电荷,然后迅速移入标记的存储区域。而信号的受光部的传感器被集成时,所存储的电荷被读出。

 

科学应用的波长选择过滤器或传感器的摄像头单CCD摄像头,用于两种类型的数码相机的色彩。两者都使用过滤器来产生红色,绿色和蓝色的版本的字段的视图。单传感器摄像机使用一个滤光轮或液晶可调谐滤波器,获得红色,绿色和蓝色的图像顺序的。三个传感器的相机有一个分光棱镜和修剪过滤器,使每个传感器图像适当的颜色,并同时获得所有三个图像。不变的是,彩色摄像机的比单色因为加分束和波长选择元件较不敏感。在某些应用中,特别是免疫能力或快速连续同时捕捉多个波长的灵敏度的损失所抵消。此外,一些彩色摄像机达到一个更高的分辨率,通过对角抵消了红色,绿色和蓝色的传感器,每个传感器的像素的三分之一,从而增加两倍获得的样本的数目。

 

虽然CCD摄像机的制造商和用户经常是指每个光电二极管的像素(图像元素),就没有必要的传感器和在计算机监视器或打印机中的像素的数量和位置之间的对应关系。然而,显示器或打印机的分辨率应至少高达传感器。

 

量子效率

量子效率(QE)是指,被检测到的入射光子数的百分比。(为便于参考,我们的明视觉的QE3%左右;3)。硅光电二极管,CCD的基本构造块的,具有较高的量子效率(80%)在广泛的范围的可见光谱和近红外到,如在图3中示出。的CCD的分光灵敏度低于一个简单的硅光电二极管,因为CCD电荷转移通道在其表面上,可以降低峰值量子效率为约40%。

quantumefficiency

最近,一些科学级CCD的渠道的透明度已增加,量化宽松政策在蓝绿色的范围提高到近70%。从表面通道的损失完全消除在背照式CCD。在本设计中,光落到后面的CCD的区域中,已经通过蚀刻减薄,直到它是透明的。可实现高达90%的量子效率。然而,早变薄的结果是,至今为止,只采用科学级,慢扫描CCD相机在一个微妙的,相对昂贵的传感器。

 

CCD相机的噪声

有两个主要的噪声源在CCD相机的暗噪声和读出噪声。虽然已取得了很大的改进在过去的几年里,在室温下在减少CCD暗噪声,冷却芯片进一步降低了噪音每20℃下降了十倍。黑暗的噪音是最明显的,因为在积分周期为45秒后,与室温CCD相机获得的图像的像素(白点)。冷却至0℃,通常是足够的积分周期长达30秒。需要很长的风险(例如,化学发光法)的实验需要传感器的温度更低。数码相机提供在非制冷或制冷版本。

noise

噪声源不同,数码相机,以及几种常见的类型为示波器图4中的痕迹。光子噪声,暗电流,固定模式噪声,和光响应不均匀性所产生的CCD的本身,而复位噪声,I / f噪声和量化噪声的数字输出的模拟信号的放大和转换过程中发生。CCD芯片上,每个光电二极管所存储的电荷(即,像素)转换成要量化的A / D转换的模拟电压的放大器中产生的读出噪声。读出噪声可以被看作是收费,用于读取所存储的电荷必须支付。如果此收费已稳步下降5-10电子/像素由于在CCD设计的改进,在过去的几年中,时钟和抽样方法的大小。读出噪声读出速度成比例地增加。去的成本,更快的更多的噪声,因此,更多的不确定性中的电压确定较低分辨率的位数号码。这就是为什么慢扫描摄像机通常具有较低的读出噪声比更快的输出检测器,并具有较高的有用比特数。数字came4ras范围从8-12位深度为30帧每秒输出16位深度在1-2帧每秒。

 

要的速度/读出噪声问题的解决方案之一是在一个大的CCD使用多个输出放大器(抽头)。而不是读取所存储的电荷,从整个CCD通过一个输出放大器,该传感器被分为4个或8个部分,每个都具有其自己的放大器。图像读出部分,然后缝合在一起,在软件中的每秒数帧的速率。每个放大器所需的速度和相关的噪音也相应降低。

 

信号噪声比

由于光子随机到达传感器表面,它们的数量波动与泊松统计检测到的光子数的平方根等于所描述的噪声。当然,相机噪音将这个光子的统计噪声,进一步降低S / N。最高的S / N,可以通过一台数码相机的最大累积电荷(全井容量)的平方根。一个简单的估计点的任何图像的同质区域的S / N是该地区的平均强度除以该地区的强度的标准偏差的利息。

 

多少像素的数码相机已经足够?

的分辨率的CCD光电二极管和它们的大小相对于投影的图像的数量的函数。现在已是司空见惯的数码相机CCD 1000×1000的光电二极管阵列。消费者和科学级CCD制造的趋势是减少,传感器尺寸为4 x 4微米小一些CCD光电二极管。从采样理论,只能达到足够的分辨率的一个对象,如果至少有两个样本为每一个解析的单元。(许多用户喜欢三个样品每解析单位,以确保有足够的采样)。

最大分辨率像素的大小要求
在光学显微镜

物镜
(数值孔径)

分辨率限制
(微米)

投影尺寸CCD 
(微米)

所需的像素大小
(微米)

4X0.20

1.5

5.8

2.9

10X0.45

0.64

6.4

3.2

20X0.75

0.39

7.7

3.9

40X0.85

0.34

13.6

6.8

40X1.30

0.22

8.9

4.5

60X0.95

0.31

18.3

9.2

60X1.40

0.21

12.4

6.2

100×0.90

0.32

32.0

16.0

100×1.25

0.23

23.0

11.5

100X1.40

0.21

21.0

10.5

1

 

在落射荧光显微镜,阿贝1.4的数值孔径镜头在550纳米的衍射极限是0.22微米。100倍的物镜,受衍射限制的点上的CCD面对投影大小为22微米。只是让一个光电二极管尺寸为11×11微米的光学和电子的分辨率要匹配,一个7×7微米光电二极管的首选。在光学显微镜的最大分辨率像素大小的要求列在表1中的4倍到100倍的物镜放大倍率范围。100倍的物镜并没有额外的放大倍率7×7微米的光电二极管,1000×1000 CCD捕获70×70微米的物体平面的一个字段的视图。当适当的采样适当地调整大小的图像投射到CCCD,更大数量的CCD中的光电二极管,而不是增加该字段的视图的分辨率。各种输出设备的分辨率的要求,可能需要在传感器的过采样,使最终的产品(例如,幻灯片,打印或海报)有足够的分辨率的最终尺寸。

 

动态范围

intrascene动态范围表示的强度的有用的范围内,可同时检测到相同的字段的视图。interscene的是动态范围的强度的范围内时,可以容纳不同的视场的检测器增益,积分时间,镜头的光圈或其他变量作相应调整。虽然小的CCD传感器上从分辨率的角度来看是可取的,它们限制了动态范围内的设备。的CCD的全阱容量是约1000倍,每个光电二极管的横截面面积。因此,7 X7微米像素的CCD全阱容量49000电子或空穴。(甲孔的区域的硅从该电子来构成和检测到的光子的同样有效的,可以使用的措施。使用的术语电子,虽然大多数的CCD读出产生的空穴而不是电子的数量。)由于CCD的不具有固有的增益,一个电子 空穴对的每个检测到的光子的累积。

通常被定义为全井容量除以由相机噪声的CCD的动态范围。黑暗中,读出噪声的总和的平方和的平方根计算的相机噪声。因此,一个49000电子全井产能的CCD读出噪声和暗噪声可以忽略不计的10个电子的动态范围大约是4900,对应于12位。但是,数字化,如果这样的相机的输出在12位深度意味着,49000电子分为4096 A / D转换单元,每个包含12个电子(四千九十六分之四万九)。由于噪声是10个电子,每个灰度级的步骤仅是1.2倍的噪音和不能够被辨别。在10位的数字化会导致在每个A / D单元49的电子,约5倍的噪声电平,并在1024个灰度级中的每一个然后可以判别。一个制表位深度的灰度层次和动态范围(分贝)表2所示,它涵盖了一系列有五个量级。

 

控制速度,有效像素尺寸和实地查看

慢扫描的数码相机允许的控制所读出的速率,在像素的有效大小,构成一个传感器和该字段的视图。科学级CCD相机通常提供两个或两个以上的读出率,所以,速度可抵销噪音交易。一个像素的有效尺寸,在许多慢扫描数码相机可以增加分箱,一种方法,其中从集群中的相邻光电二极管的电荷汇集和处理,如果是来自一个更大的探测器。

 

电荷耦合器件的动态范围

位深度

灰度
级别

动态范围
(分贝)

1

2

6分贝

2

4

12分贝

3

8

18分贝

4

16

24分贝

5

32

30分贝

6

64

36分贝

7

128

42分贝

8

256

48分贝

9

512

54分贝

10

1,024

60分贝

11

2,048

66分贝

12

4,096

72分贝

13

8,192

78分贝

14

16,384

84分贝

16

65,536

96分贝

18

262,144

108分贝

20

1,048,576

120分贝

2

 

分级是有用的,当光线水平非常低,几个光子的检测,因为它使研究者交易空间分辨率灵敏度。此外,最慢扫描CCD相机允许的感兴趣区域读出选定的图像部分中,可以显示和所积累的电荷的其余部分被丢弃。的划分率一般增加成比例地减少领域的视图。例如,有传感器的CCD大小为1000×1000 10/ s,可以产生100/秒,如果所读出的区域被减少到100×100二极管的输出速率。通过交易过场的视图和帧速率,研究者可以调整到一个更广泛的范围内试验的情况下,将有可能比具有固定的帧速率摄像机。

 

强化数码相机

现在,一些制造商提供数码相机配备了非常低的微光成像图像增强。这些具有接近的光电阴极,微通道板电子倍增器和磷光发光性的输出画面(参见图5中的插图)。在这些设备的最新一代的光电面具有较高的量子效率(高达50%),在蓝绿色端的频谱。放大器的增益是在很宽的范围内具有典型的最大为约80000的调节。从光电面以及从微通道板作为电子倍增噪声降低热噪声的S / N在一个增强型CCD相机下面是一个缓慢的扫描CCD。强化CCD的分辨率取决于增压器和CCD的,但通常是有限的增强微通道板几何至75%左右,单独的CCD

gen2

愈演愈烈的数码相机有一个的降低动态(和intrascene动态)范围比较慢扫描相机,而且大多数是有限的10位分辨率。放大器增益可以快速和可重复地改变,以适应场景亮度的变化,从而增加在interscene动态范围。

 

事实上,由于图像增强可门,也就是说,关闭或在几纳秒,相对明亮的物体,可以可视化的的时间减少。门控,强化数码相机最需要的时间分辨荧光显微镜的应用,因为探测器调制高频增益必须在光源同步。由于活细胞所需的低光照通量,增强型CCD相机经常研究动态事件和比率成像。

 

选择适当的相机

没有任何单一的检测,在荧光显微镜将满足所有要求,所以的研究者必须妥协。曝光时间往往是最重要的参数。当时间是形象整合,慢扫描CCD相机的表现将优于强化相机在各个领域,在很大程度上是因为其更高的量子效率和更低的噪音。冷却总是提高数码相机的性能,但差异可能并不明显,当积分时间为几秒或更少的数字化深度为8-12位。对于涉及数字反卷积的应用中,检测器的选择是水冷,科学级,慢扫描的摄像头,能够产生一个高分辨率的,14-16-位的图像。光电二极管的尺寸事项;一些CCD具有这么小的像素,可能不得不被限制,以避免饱和的电荷存储阱,结果可能会受到影响的动态范围和峰值的S / N的积分周期。如果被调查事件是快速的,但可以精确地触发,然后缓慢扫描CCD工作在突发模式或高速模式可能是合适的。然而,当该事件是不容易预测,试样必须在低入射光通量连续监测,增强型CCD检测器给出。出于这个原因,单分子荧光成像使用加强的数码相机。

mouseintestine

的显微照片,图6给出了三重染色与一些荧光发色团的薄边的小鼠小肠是一个组合epi-fluorescence/phase的对比度的图像。一个尼康的Eclipse E600,类似于一个如图1所示,利用与尼康DXM 1200数码相机记录的图像,如图6。当彩色图像所需的常规的组织学标本三个CCD摄像机是优选的一个不可分割的颜色掩模廉价的单传感器的摄像头。高分辨率,单传感器CCD摄像头,配备了一个可拆卸的,红,绿,蓝,液晶滤波器已被证明是非常有用的明场和荧光显微镜。

 

前景

最近的CMOS(互补金属氧化物半导体)摄像头预示着一个潜在的未来的重要作用,这些设备在荧光显微镜的性能改善。CMOS摄像头在一个集成芯片上的格式的每个光电二极管与一个放大器和数字化。其结果是成本低,结构紧凑,通用的检测器的优点相结合的硅检测没有问题的电荷转移。CMOS传感器允许再次操纵单个光电二极管,感兴趣区域的读出,高速采样,电子快门和曝光格式的计算机界面。直到最近,他们遭受高的固定模式噪声相关的开关和采样文物,但现在正在迅速解决这些问题。它是可能的,他们将替换为在不久的将来的科学应用在数码相机的CCD