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奥林巴斯显微镜:暗场显微镜的照明

2013-10-16  发布者:admin 

我们所有的人都相当熟悉的外观和知名度的恒星在一个漆黑的夜晚,尽管他们从地球上的巨大距离。明星可以很容易地观察到夜间,主要是因为微弱的光线和黑色的天空形成了鲜明的对比。

cardioid

但是星辰都闪耀着都晚一天,但他们白天是看不见的,因为压倒性的亮度的太阳铺天盖地从星星微弱的光线,使他们看不见。在日全食期间,月亮进入地球和太阳之间的太阳和星星的光挡住了,现在可以看到,即使是白天。总之,对一个黑暗的背景暗淡的恒星光的知名度,极大地提高。

 

这一原则适用在暗视野(也称为darkground)的显微镜未染色透明标本清晰可见,一个简单而常用的方法。这样的对象通常具有非常接近的值与其周围环境的折射率,并在常规的明视野显微镜难以成像。比如,许多小的水生生物的取值范围从1.21.4的折射率,从而在从周围的水介质中的光程差可以忽略不计。这些暗场照明的理想人选。

 

暗场照明要求挡住了中央的光通常通过左右(前后)试样,只允许斜光线从各个方位,以罢工的显微镜载玻片上镶嵌的试样。一个简单的阿贝暗场​​聚光透镜顶部的凹球面状,让光线从表面在所有方位新兴顶点集中在试样平面形成一个倒置的中空锥光。如果没有试样本和聚光镜的数值孔径超过物镜的倾斜射线交叉和所有这样的光线进入的物镜,因为他们的倾角会错过。视野会变暗。

 

暗场聚光镜/物镜对图1中所示的是一个高数值孔径的安排,表示在其最先进的配置,这将在下面详细讨论的暗视野显微镜。的物镜包含一个内部的可变光阑的作用是降低的物镜的数值孔径值低于倒中空发射的光锥通过聚光镜。心形电容是反射的暗场的设计依赖于内部的镜子,投射到标本平面无像差的光锥。

 

上滑动,特别是未染色的,非光吸收试样,当试样被放置的倾斜射线穿过试样,衍射,反射和/或折射光的不连续性(如细胞膜,细胞核,和内部的细胞器)让这些微弱的光线进入物镜。标本否则黑色的背景上,然后可以看到明亮。暗场照明在傅里叶光学方面,消除零阶(未散射光)的衍射图案,形成在后侧焦点面上的物镜。这会导致形成的图像中完全从试样散射的高阶衍射强度。

radiolarians

2中的显微照片说明暗场和明照明的效果,在整个安装试样从一个小海洋原生动物(放射)的二氧化硅骨架。在普通明场,放射虫的骨骼特征是没有得到很好的定义,往往无论是与传统的胶片或数字捕获显微照片记录被淘汰。与聚光镜孔径光阑收到一个点的衍射工件模糊的一些示例的细节,在图2a)的显微照片拍摄于明照明。这增强了图像失真为代价的标本的对比。暗场照明下(图2b)),更详细地存在,特别是在上部的有机体,并且图像获取一个明显的三维外观。放射需要用暗场停止(图2c))一起使用时,红色滤光片,丰富多彩的外观,更令人愉快,虽然没有产生的附加详细信息,甚至还有一些图像质量的降低。

 

标本有光滑的反射面产生的图像,由于部分反射光到物镜。在从周围介质中,或发生的折射率梯度(在边缘的膜)的折射率不同的情况下,光的折射的试样。这两种情况下,反射和折射产生的光的方向的相对较小的角度变化,允许一些进入物镜。与此相反,一些光撞击试样也是衍射,穿过整个物镜的数值孔径范围内的光,产生一个180度的弧。的物镜的分辨能力是相同的明视场条件下所观察到的,但在暗场照明的图像的光学字符不是忠实地再现(除非利用一个专门设计的可变光阑时降低的有效数值孔径与高倍率油浸专为暗视野显微镜物镜)。

 

在上述的例子中的星光的可见性也大大提高了由光辉试样和暗环绕之间的对比度。如上所述,在暗场照明发生了什么事是所有通常不偏离的零阶射线不透明站已被封锁。斜射线衍射试样,得到第一,第二,和更高衍射级的物镜,请他们与试样以产生图像干扰到成像面的后侧焦点面。

 

暗场照明的理想人选包括分钟的水生生物,微生物,硅藻,小昆虫,骨,纤维,头发,未染色的细菌,酵母,细胞组织培养,和原生动物。非生物标本包括矿物和化学晶体,胶体颗粒,灰尘计数标本,而薄的部分聚合物和陶瓷含有细小的夹杂物,孔隙度的差异,或折射率梯度。准备暗视野显微镜标本时,应谨慎,因为躺在焦点平面的上方和下方的功能也可以散射光线,有助于图像退化。用试样的厚度和显微镜载片上的厚度也是非常重要的,在一般情况下,薄的试样衍射工件,可以干扰图像形成期望消除的可能性。

abbedark

3中所示台下聚光镜展示一个不透明的光路径上停止的效果,通过一个简单的折射聚光镜。在左侧(图3a)),是一个典型的阿贝明场聚光镜的位置与打开以最大限度地提高光锥的数值孔径的孔径光阑。来自源的光通过光阑,然后通过几个透镜元件折射,形成一个倒锥形的光的数值孔径约1.20。低于完全打开的孔径光阑,当一个不透明的蜘蛛式灯停止(图3b))插入的中心的光线被阻挡,只允许周围光线通过透镜,以形成一个倒置的斜中空的光锥数值孔径(1.20)没有变化。照明空心光锥是由光折射在周长镜片,光学矫正往往是最穷的。即使如此,聚光镜将充分履行使用低倍率的物镜,进行定性暗场工作产生非常好的结果。对于更为精细量化显微镜,有必要使用消球差的聚光镜(色差和球面像差的校正),通过产生的图像更清晰的细节和更可靠的功能性能要好得多。

 

在暗视野显微镜,如果你是通过背面的物镜伯特兰镜头或望远镜相看,它似乎充满光明。这种微弱的衍射光改组为目镜膜片的平面与可见光图像的对比度逆转,在黑色背景上明亮的图像。由于暗视野显微镜消除明亮的不偏离的光,这是非常浪费的光照明形式,并因此要求高强度的照明光源。显微镜载物片必须是适当的厚度,约1毫米+ / - 0.1毫米。玻片标本在光路中的光学表面必须非常干净,因为每一个的污垢斑点会无情地亮。

 

有几件装备,利用暗场照明。最简单的是蜘蛛下底台下聚光透镜(前焦面)(图3b)和图4a))下停止。光圈和视场光阑敞开通过斜射线。中央不透明停止(你可以做一个透明的玻璃盘上安装一个硬币)块中央的光线。这个装置的工作原理相当,甚至与阿贝聚光镜(图3),10倍的物镜高达40倍或更高的物镜不高于0.65的数值孔径。不透光的光阑的直径应为10x物镜的数值孔径为0.25至约20-24毫米的20倍和40倍的物镜接近0.65的数值孔径大约为16-18毫米。

 

在图4所示的停止集(一)大小不等,从8毫米到30毫米,并提供出色的暗视野不透明停止,几乎所有的数值孔径的物镜(0.65以下)。个人站可以互换,简单地通过除去螺钉的底部支撑蜘蛛更换站与新的大小。的蜘蛛保持器的外尺寸会有所不同,这取决于在聚光镜底部的壳体开口直径。

 

在图4中示出的光停止(b)是一种巧妙的反向虹膜隔膜,来增加或减少的大小,在停止使用的操纵杆控制臂的膨胀和收缩。由于此杆转动时,中央叶的大小的变化为约10毫米,25毫米直径的,更高的放大倍率的物镜创造更大范围内的停止。这种类型的可变光停止隔膜消除了需要用于改变光站的更高的功率的物镜是,每次插入到光路中。它也有附加的优点是在必要的点直径,以达到最佳的性能,同时观察试样的略有不同的可调。虽然这些类型的隔膜光停止现在非常罕见,他们提供了一个独特的方法,达到非常理想的效果,暗场照明。

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几乎任何明场实验室显微镜可以很容易地转换使用暗场照明。如上所述,中央不透明停止可以被塑造从一个小硬币,纸板,塑料,或黑色的纸,可以放置在过滤器载体下方的聚光镜(或用胶带贴在聚光镜底部),以阻止光线进入前透镜的物镜。不透光的光阑的直径会有所不同,从物镜物镜,应仔细测量在台下上过滤器的载体,并保持稳定的对聚光镜的底部放置一个透明的标尺。接下来,确定通过除去一个目镜观察使用相望远镜(或通过插入一个勃氏镜)的物镜上面的后焦平面的图像的标尺的开口尺寸。肯定的是,台下聚光孔径和视场光阑打开执行这个动作之前,其最宽位置。标尺隔板,显示在后焦面的数量将等于到停止要阻止零阶光进入的物镜的大小。切换到下一个最大规模的物镜,并采取另一种测量,重复,直到停止尺寸已知的所有物镜都。

 

近似不透光的光阑的大小与倍率指南表1中给出。的实际尺寸会有所不同,这取决于几个因素,包括接近的停止相对于聚光镜孔径光阑,物镜聚光镜,用于聚光镜的像差校正的程度,和目镜的视场数的数值孔径。在确定停止的大小也很重要的是的聚光镜后透镜,目镜倍率(放大倍率较小,需要稍微大一些的停止),和安装介质不同的直径。停止的大小成比例地变化安装介质的折射率高的折射率需要一个更大的停止。干燥的坐骑也将需要一个更小的站比的水悬浮液。

视场光阑直径大小

放大

数值孔径

停止尺寸(mm

1X

0.03

25-30

2X

0.05

8-11

4X

0.10

8-14

10X

0.25

16-18

20X

0.40

18-20

20X

0.65

20-22

40X

0.65

22-24

1

 

使用剪刀或(优选)的黄铜打孔器切一组相匹配的所有的物镜的停止,明确乙酸乙酯一个坚固的片材或玻璃胶。乙酸盐或玻璃基片应该是很容易地安装到台下聚光的底面,可以通过一个过滤器保持器,或通过其他方式,如粘接带。停止的对齐方式,可以通过观察通过伯特兰透镜或卸下目镜,同时调整聚光镜中螺钉通过相位望远镜观看。

 

暗视野显微镜在高放大倍率

为了更精确的工作和黑背景,你可以选择一个聚光镜设计,尤其是暗场,即仅传输斜光线。有几个品种:暗场聚光镜与空气之间的聚光镜顶部和底部的滑动-和浸泡一滴浸油的使用(一些被设计为使用水代替)的的暗视野聚光镜需要建立聚光镜顶部和底面的样品载玻片之间的接触。浸入式暗场聚光镜,内部镜面,并通过射线伟大的斜率和无色差,产生最好的效果和最黑暗的背景。

 

也许是最广泛使用的暗视野聚光镜是抛物面,非常精确地由一块实心的玻璃地面成抛物面的形状,如图5b)中示出。将集中于一个抛物面聚光镜的反射面(在图5b)的玻璃和聚光镜壳体之间)的光入射在反射器的焦点处。最受欢迎的抛物面的聚光镜被切断,以确保焦点稍稍超出了聚光镜顶部,使平行光线将聚焦在试样的照明的位置,最大限度地提高。的光的玻璃聚光镜的底部停在用来挡住到达试样的中心射线。由聚光反射的光线角度高于反射的临界角,并会聚在聚光镜的主要焦点。载玻片上,安装介质,浸油的组合(聚光镜和载玻片之间)完成的抛物面形状的光学均匀性。

 

highnadark

正如上面所讨论的,干燥的暗视野聚光为0.75以下的数值孔径(图图5a))的物镜是有用的,而抛物面形和心形的浸没式聚光镜(图1和图5b)),可以使用非常高的数值的物镜孔(高达1.4)。高于1.2的数值孔径的物镜,将需要一些工作光圈,因为他们的最大数值孔径的减少可能会超过聚光镜的数值孔径,从而使直射光进入物镜。出于这个原因,许多高数值孔径的用于暗场和明照明设计的物镜是由一个内置的调节可变光阑的孔径光阑作为 这种数值孔径的减少也限制了物镜的分辨能力,以及在图像中的光的强度。专门设计的暗场工作的专门的物镜产生的最大数值孔径接近暗视野聚光镜的数值孔径的下限。他们没有内部光阑,但是镜头卡口的直径被调整以使至少一个内部透镜具有执行作为孔径光阑的最佳直径。

 

2列出了几种最常见的反射高数值孔径暗场聚光镜。此表应该被用来作为一个指南,当选择高数值孔径的暗场应用程序的使用的聚光镜/物镜组合。

 

高数值孔径暗场聚光镜规格

聚光镜类型

空心锥形
数值孔径

物镜的最大
数值孔径

反射
表面的数目

光学矫正

抛物面

1.00-1.40

0.85

1抛物线

消色

1.20-1.30

1.05

1
1 Cardioidal

消色差
消球差

Bicentric

1.20-1.30

1.05

1 Cardioidal 
1

消球差

Bispheric

1.20-1.30

1.05

2球面

消球差

卡塞格林

1.40-1.50

1.30

1非球面
球面

消球差

点戒指
Bicentric

1.40-1.50

1.30

2球面

消球差

纳尔逊
卡塞格林

1.30-1.45

1.20

1非球面
球面

消球差

2

 

如图5所示的聚光镜是专为生产高数值孔径斜空心光锥暗场照明。在这两种情况下,在聚光镜的上表面的平面和垂直于光轴的显微镜。在左边的聚光镜(图5a))被设计为使用无油之间的聚光镜和底面的显微镜载片上的“ 干 。与此相反,在图5b)的抛物面聚光镜的目的是“ 油 的显微镜载片上的底部,直接指向下方的试样。省略浸油,使用这种聚光镜(或任何其他聚光镜列于表2)时,将排除任何光线到达试样。由这些聚光镜发出的光线的倾斜的空心锥形不能摆脱顶端透镜无油的情况下,将完全反射回进入聚光镜。从照明光源发射的光被反射的镜面玻璃表面的聚光镜聚光镜顶部排出,在高得多的倾斜角超过临界角(约41度)的内部发生全反射的光通过的内从玻璃进入空气。的情况下,涂油抛物面聚光镜(图5b)和表2中的聚光镜聚光镜玻璃,浸油,玻璃载片的折射率相等,发射的光从聚光镜通过试样unrefracted玻璃-空气界面。

 

反映高数值孔径聚光镜列于表2,涵盖广泛用于需要高倍率暗视野显微镜的光产生斜空心锥形设计。已经在上面详细讨论的抛物面天线的暗视野聚光。另一个非常有用的设计是图1中所示的心形电容。此的聚光镜设计采用镜像半球中停止的光与直射光的反射器到第二个反射面形状类似于心革命,从聚光镜源于它的名字,作为聚光镜的中心。球形,心形反射面的结合,产生一个的聚光镜是免费从昏迷和球形和色差。有几种技术的缺点,使用这种高数值孔径的聚光镜。心形电容对齐非常敏感,必须谨慎地利用非常尖锐的光锥,使最困难的暗场聚光镜使用。此外,聚光镜产生了显着的眩光量,即使是从最微小的灰尘颗粒,短焦距,可能会导致照明差超过几微米的尺寸或厚度的对象上。选择定量高倍率暗视野显微镜显微镜载玻片时,请一定要选择从玻璃无荧光杂质的混合物,制成幻灯片。

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高数值孔径的反射暗场照明的聚光镜(图1,图5,图6和表2)与所选择的方法为了观察,拍摄非常小的颗粒或胶体悬浮液的集合,即使当粒径明显低于分辨率的极限了的物镜。这是由于光衍射的粒子,通过物镜,并成为作为可见明亮的衍射磁盘。每个粒子可见为一分钟衍射磁盘,大于相邻颗粒之间的横向距离的物镜的分辨能力的极限。作为照明强度增加时,光程差之间的分钟的衍射颗粒和背景增加。同时,现在甚至更小的颗粒(单靠自己的能力散射光检测)衍射足够的光线变得可见,即使当其直径小于40纳米,这是大约五分之一的200纳米的分辨率极限,可以看出悬浮颗粒油浸物镜的最高的数值孔径。在生物应用中,生活可以观察和拍摄使用高数值孔径的暗场聚光镜的平均直径约20纳米(太小看出明或DIC照明)的细菌鞭毛运动。

 

应特别注意支付到注油高数值孔径的聚光镜的底部样品载玻片的细节。这是非常困难的,以避免引入的微小气泡到聚光镜顶部透镜的显微镜载片上的底部之间的区域中,此技术应实行完美。气泡会导致图像的眩光和失真,对比度和整体形象退化导致的损失。使用显微镜载玻片,要么太厚或太薄时也遇到问题。许多暗场的聚光镜中含有可用幻灯片的厚度范围内的聚光器支架上直接刻。如果滑动太厚,不采取较高的粘度浸油的情况下,往往是难以聚焦聚光。另一方面,太薄的幻灯片有分解倾向聚光镜油之间的键和滑动。这是一个很好的主意,购买精密显微镜载玻片正确的厚度,以避免上述问题。

 

标本浸泡在水溶液中一个独特的情况出现时,正在使用高数值孔径的暗场聚光镜成像。在这些条件下的水溶液的折射率的限制下,光可以通过从入水(1.336 例)试样周围的玻璃显微镜载片上(1.515 例)的倾斜角度。的最大数值孔径的光通过玻璃水是由下面的公式给出:

 

NA (illumination) = 1.555 × sin(i) = 1.336 × sin(90°)

and because sin(90°) = 1

NA (illumination) = 1.336

 

尽管反射的上限高的数值孔径为1.50(见表2),设计用于浸油的暗场式聚光镜列照明在含水介质中的标本的光必须具有不大于1.336,有效的减少了的数值孔径暗场照明的上限。暗场照明的数值孔径高的折射率的液体中浸渍的试样的情况下,有效的上限可以接近最多为1.50,虽然这是在实践中难以实现。

 

是否打算用于干性或油,高数值孔径的聚光镜,必须准确地集中在显微镜的光路中,以实现最佳的性能。为了实现这一物镜,许多暗视野聚光镜构建刻的上表面上,以帮助在中心聚光镜与一个小圆圈。具有低功耗(10倍,20倍)物镜进行成像的刻圆定心,定心螺钉,以确保正确为中心的圆(和聚光镜)的光路中使用的聚光镜。暗场照明显微镜对准的更多详细信息,请咨询我们的部分在其他地方暗视野显微镜配置显微镜底漆。

 

在一般情况下,在适当条件下暗场照明成像的对象是相当壮观看(例如尝试一滴新鲜血液暗场)。标本通常含有非常低的固有对比度在明显微镜暗场大放异彩。这样的照明是最好的暴露轮廓,边缘,边界,和折射率梯度。不幸的是,暗场照明内部细节中透出的那么有用。

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其他类型的标本,包括许多染色,也很好地回应暗场条件下的照明。图7示出了三种类型的样品,所有这些都产生良好的对比度在明场和暗场照明的暗场显微照片。在体内的鹿蜱(硬蜱demmini),在图7a)所示的详细信息可在明洗涤,除非聚光镜光圈缩小,以最大限度地提高对比度。然而,在暗视野中,大多数的标本细节虱子变得可见,可以很容易地在胶片上拍摄的。重染寄生虫吸虫(棘revolutum,图7b))也发现相当多的细节,暗场条件下照射时,蚕的气管和气门在图7c)所示。除了上述例子外,也可以被视为一些其他标本,明场和暗场照明下拍摄,以达到预期的效果。

 

在上半年的20世纪,暗视野显微镜下面有一个非常强大的,在花费了很大精力优化暗场聚光镜和照明的。这种强烈的兴趣开始慢慢褪色的出现更先进的对比增强技术,如相衬,微分干涉相衬,霍夫曼调制对比。最近,一个新的兴趣已经出现在传输的暗视野显微镜荧光显微镜结合使用时,由于自身的优点。

 

暗视野显微镜仍然是生物和医学研究的一个很好的工具。它可以有效地使用在高放大倍率拍摄生活的细菌,或在低倍率来查看和照片细胞,组织和整个坐骑。海洋生物学家在低权力继续使用暗场照明,淡水和咸水生物,如藻类和浮游生物观察和记录数据。