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尼康显微镜:维持活细胞显微镜载物台上

2013-10-16  发布者:admin 

越来越多的调查,使用活细胞成像技术的基本性质,细胞和组织的功能,特别是由于目前正在目睹荧光蛋白合成荧光技术的快速进步提供重要的洞察。由于这些进步,活细胞成像已经成为必要的分析工具,在大多数细胞生物学实验室,以及一个常规的方法,在广泛领域的神经生物学,发育生物学,药理学,和许多其他相关的生物医学研究的学科实line。其中最重要的技术挑战进line成功的活细胞成像实验是细胞维持在一个健康的状态,并合成荧光和/或荧光蛋白的存在而被照亮显微镜舞台上正常工作。

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环境的严密的控制是一个成功活细胞成像实验中的最重要的因素。特别是,在何种条件下细胞的显微镜载物台保持,虽然在许多要求,这取决于生物体广泛变量,往往决定了一个实验的成功或失败的。容易地操纵包括环境方面的腔室中,细胞的生长和成像的物理参数,温度控制的本地化程度,大气条件(气体混合物和湿度),营养增补剂,生长培养基中的缓冲液(pH),培养基的渗透压。

 

1中所示的一系列的捕获的图像从几个不相关的细胞系,每个标记的合成的荧光基团和/或荧光蛋白的不同组合。兔肾上皮细胞(RK-13 line,在图1a)与增强型黄色荧光蛋白(EYFP)和核靶向信号肽,在细胞核中定位一种黄绿色的标签的融合质粒转染。随后用MitoTracker Red CMXRos的细胞染色的线粒体。在图1b)中,负鼠肾近端小管上皮细胞(OK)转染EYFP-actin蛋白的亚细胞定位载体标记的丝状肌动蛋白细胞骨架网络。线粒体有针对性与DsRed2在图1c)在印度麂细胞融合载体,,而EGFP-peroxisomal的嵌合质粒亮点过氧化物酶在人宫颈癌细胞(HeLa line)在图1d)。正常的金色叙利亚仓鼠肾成纤维细胞(BHK-21line)的贴壁培养的精选图1eDsRed2 FP-内质网和EGFP-细胞核亚细胞定位载体转染的混合物,从而本地化绿色荧光蛋白标签细胞核和橙红色的探针的内质网。最后,人骨骨肉瘤细胞(U2OS line),图1g)中示出的转染与天蓝荧光蛋白融合到线粒体靶序列标签线粒体。对于图1中的每一个图像,一个单独的信道被记录,可使用微分干涉对比,并且重叠的荧光通道(s),以确定小区边界和其他的共同的结构特征,如细 ​​胞核。

 

在制定计划的过程中,为活细胞的观察和长期的成像实验,是值得认真考虑的一些重要因素。试样应准确地标记的荧光团的荧光蛋白质或合成的(次)还,以便清楚地可视化的物镜生物成分。也许更重要的是,在细胞培养中,必须保持在一个条件,促进生长和正常功能,以避免潜在的工件的实验结果的解释中。此外,细胞应成像的方式,不会诱发光毒性或扰动定位的荧光探针具有足够的空间和时间分辨率。其中最重要的活细胞成像,必须加以解决(在下面详细讨论;见表1)常规考虑温度,氧,湿度,渗透压,pH值(中小型缓冲),光毒性,在实验室环境中,显微镜焦点漂移,流血通过荧光信号强度,和分辨率。

 

维持活细胞显微镜舞台上处于健康状态的任何活细胞成像调查无疑是最关键的环节,一般需要结合机械别出心裁,伴随着敏锐的洞察正在研究细胞或组织的生物学。虽然许多实验室擅长于生长温度控制二氧化碳孵化器中培养的细胞,维持长期成像实验的细胞在显微镜载物台的任务更为苛刻。成像室必须保持正常运作的持续时间的实验的细胞(或组织),同时允许通过显微镜的物镜的不受限制的访问权限。高数值孔径的油或水浸泡物镜正在使用时,会变得特别困难的这一壮举。在许多情况下,调查员必须能够引进的试剂,而成像(扰乱一个​​特定的细胞的过程,而不会干扰时间推移序列转移焦点或舞台上的地位,。其他重要的因素是简单,可靠性和合理的成本。下面的讨论中主要集中于哺乳动物细胞中,但其他生物的各种技术之间的轻微差异,通常是不严格的。例如,酵母,昆虫,和植物细胞的培养物没有严格的温度要求,介质组合物,而不是细菌细胞的要求。

 

培养介质哺乳动物细胞系

尽管媒体在细胞和组织培养的早期尝试的混合物,含有胚胎提取物,血清,的蛋白质hydrosylates和主机其他体液传播,迅速 ​​过渡到生化要求的基础上定义的媒体建立。其中,最流line的是鹰的基础(EBM)和最小基本(MEM)文化传媒,贝科的修改MEMDMEM),火腿的媒体(F-10F-12),和2高度精炼的媒体配方设计在罗斯韦尔公园纪念研究所(RPMI 1640RPMI 199)的。此外,设计的碳酸氢盐缓冲液的情况下(和二氧化碳)中培养细胞的培养基中,LeibovitzL-15,已被广泛采用。所有这些培养基都需要添加血清(通常来自于胎儿和新生儿的牛犊或马),至终体积分数5%和20%之间不等。严格定义的条件下,在生物制药line业中的应用受益,也已发展为高度专业化的培养细胞无血清培养基。许多实验室在培养涉及各种各样的细胞类型往往危及一个确切的配方的严格要求使用一个复杂的介质,如火腿的F-12的混合物,与一第二介质(DMEM培养液,例如)含有较高的氨基酸酸和维生素的浓度。

 

细胞培养基的组合物,差别很大,但大多数配方包括氨基酸,维生素,无机盐(矿物质),微量元素,核酸成分(基地和核苷),糖,酶,脂类,三羧酸循环的中间体,各种其他生化。简单的媒体,如MEM,含有必需氨基酸的氨基酸,维生素,和它的盐,而更复杂的配方(RPMI及无血清培养基)有数百个组件。细胞培养基通常是为特定目的而设计的,包括常规增长的正常永生(转化)的细胞株,小学文化的萌生,病毒传播,药物制剂,并定义遗传变异的生长条件。在所有组织培养的培养基配方的控制变量之间的pH值,缓冲容量,氧浓度,渗透压,粘度,表面张力。当细胞在显微镜成像,即使是很短的时间,这些相同的培养基条件下,必须仔细地再现中的活细胞成像系统。

哺乳动物细胞系的环境变量

变量

最佳范围

评论

温度

28-37°C

与标本室加热器控制
使用内嵌灌注加热器,
物镜加热器
环境控制箱

氧合

变量

灌注或定期更改媒体
使用大腔容积

湿度

97-100

封闭(密封)商会
加湿环境商会
自动填充系统开放钱伯斯

pH

7.0-7.7

使用HEPES缓冲媒体
灌注或定期更改媒体
无酚红指示剂

渗透压

260-320 MOSM

避免蒸发
封闭(密封)商会
加湿环境商会

气氛

空气或5-7
二氧化碳

使用HEPES缓冲控制空气
封闭(密封)商会
大气媒体的商会

媒体缓冲区

碳酸氢盐或
合成生物缓冲剂

谨防光毒性
封闭式和开放式钱伯斯
气控制商会

1

大多数流line的活细胞成像实验中使用的细胞株生长非常好,在一个狭窄的范围内的pH值在7.27.4之间,但一些正常的成纤维细胞pH值略高(7.7)有更好的表现,而许多转化细胞系成长得更快更多的酸性介质中(pH值至7.0)。在pH值的情况下,对于实验的准确性,电镀效率测定应在物镜pH值,以确保在选定的单元格线将及格。大多数市售培养基配方中含有近似的视觉测定pH值的指示剂(酚红)。在溶液中,酚红产生一个明亮的红色色调,在pH值为7.4,在pH值为7.0,变为橙色和黄色,在pH 6.5,颜色的转变,往往是当介质变得更加酸性文化形成融合单层。在较高的pH值,在pH 7.6,酚红是粉红色的紫色,在pH 7.8和以上。许多组织培养实验室发现它很有用在平衡盐溶液在不同pH值的比较文化传媒建构一套使用酚红的pH值标准。指示剂染料虽然是必不可少的常规细胞培养,由于高的可见光吸收的消光系数,它的使用应避免在活细胞荧光成像的实验,以减少背景噪声的电平,以防止光毒性。认识到这一点,厂家提供的最常见的培养基配方在无菌液体或粉末状无酚红。

 

几乎所有细胞系都要求二氧化碳和碳酸氢盐缓冲系统来调节pH值,并且必须要严格控制浓度二氧化碳的一小部分(通常为5%至7%,根据碳酸氢盐浓度)的气氛中,在专门的孵化器中培养溶解的气体。对于活细胞成像显微镜,可以产生一个合适的气氛与二氧化碳困难和通常需要培养室是专为受规管的气氛。的引入,如合成生物缓冲剂的TRISHEPES,可疑的值已经在消除二氧化碳的要求,尽可能多的细胞株,因此无法容忍的二氧化碳缺乏,特别是在低细胞浓度。在一般情况下,1020毫摩尔HEPES缓冲液的浓度可以控制pH值在生理范围内的情况下,在二氧化碳气氛中,但培养基中仍然应该补充最佳的细胞生长,用碳酸氢钠。

 

尝试增长细胞显微镜单独使用HEPES通常会导致大幅降低增长率(尤其是长期实验),并应仔细检查每个细胞系的能力成长和功能的媒体没有二氧化碳缓冲系统。注意,补充HEPES在细胞培养基中的碳酸氢盐缓冲系统不仅降低了pH值漂移率,并且不消除将培养物暴露在大气中时所发生的碱度逐步增加。此外,许多报告已经浮出水面HEPES毒性在活细胞成像实验,推测可能是由于增加自由基的形成可视化所需的荧光探针的照明条件下合成的缓冲区。LeibovitzL-15培养基中,一个专门的配方,通过使用具有高氨基酸浓度的丙酮酸钠和缓冲的目的是消除二氧化碳。包括在培养基中丙酮酸钠使细胞增加内源性产生的二氧化碳,理论上使它们独立的气体(如碳酸氢钠)。然而,许多细胞系并没有很好地适应到L-15培养基,并配置基于这一提法的活细胞成像实验前应彻底检查几个段落。

 

细胞系可以有很大的不同,虽然他们的氧气需求正常大气中的氧张力水平将满足大多数文化。哺乳动物细胞通常需要氧气呼吸在体内,但往往可以成功地替代糖酵解(厌氧过程)时,生长在培养容器作为主线路或之后永生。以上的细胞培养液中的深度可以影响生长在玻璃或塑料的表面上的贴壁细胞的氧扩散率,并应保持低于5毫米。在大多数情况下,活细胞成像,严格氧调控是没有必要的,相反,氧气的消耗,经常被用来作为一项战略,以减少光损伤,可以通过与氧自由基反应发生在荧光照明。然而,应该指出的是,降低氧张力可以是一样有害的细胞,如果他们开始遭受低氧应激。减少的氧含量的最常用的方法涉及的商业氧气耗尽系统的应用,如Oxyrase。替代技术来限制,由于分子氧自由基的损害,包括清除剂,如抗坏血酸(抗坏血酸维生素C),或Trolox(维生素E衍生物)的培养基中添加,但降低照明强度的策略,再加上高度敏感的摄像系统也应考虑。

 

大多数流line的细胞株有一个相当广泛的公差渗透压将增长以及渗透压260320 milliosmolar之间。低渗介质中的情况下,细胞常规生长在培养皿或开放式平板培养,可以被取代的,以补偿蒸发。有机缓冲剂或筛选质粒的药物,如HEPESG-418,由另外的结构改变时,重要的是监测培养基的渗透压。在活细胞成像中的离子和有机营养成分的浓度将最初的实验中选择设置,但大多数成像室容纳少量的媒体渗透压的变化(这个问题通常是由于蒸发严重,当介质被加热到37摄氏度)。因此,必须特别注意装配时,细胞进入室,改变培养基时,如果发生任何蒸发(细胞渗透压的快速变化是非常敏感的)。此外,在成像实验,蒸发应最小化,或者通过使用一个密封的系统,由覆盖与油具有较低的密度比水(通常为矿物油中)的一个开放的腔室中的介质,或通过在成像过程中,加湿室。请注意,在一般情况中,微环境提供的一个活细胞成像腔室的体积小,在本质上是不太稳定的二氧化碳培养箱中的每一个细节需要相当多的关注。

 

选择活细胞成像细胞系

用于活细胞成像实验细胞株的选择往往决定(有限)由多项因素,包括物镜生物的调查观测能力的细胞合成荧光,转染效率,必须标明一个特定的line的严格的培养室的环境和光照条件下的耐受性。过于频繁,显示优异的性能,在一个或多个类别的细胞系进line轻微或完全在另一个失败。例如,正常牛肺动脉内皮细胞(BPAE线)可以被固定和染色,在使用合成的荧光基团揭示错综复杂的蜂窝结构的细节与细腻清晰,但的线只能在效率低(少于5%的荧光蛋白载体转染的)和相对不耐长期在低光照水平,不影响许多其他细胞系的照明。或者,兔肾上皮细胞(RK-13 line)可以用各种质粒转染高效率十分宽容延伸的数天的时间推移序列期间的高照度水平(包括激光),但没有得到充分沾上许多共同合成的荧光团(如MitoTrackers)专为活细胞成像。

 

在成功的一个最重要的因素观察活细胞的生物现象研究和成像选择特定line必须显示必要的形态和生理特性,以清楚地表明利益的概念。针对有丝分裂的研究,例如,许多细胞系不到足够的成像,由于这样的事实,分裂的细胞成为球形的,并可能从基材上分离。相反,在有丝分裂过程中保持相对平坦的,并连接到基板的细胞系是远远优于在细胞分裂过程中揭示的有丝分裂纺锤体的细节。其中最有用的lineline有丝分裂研究大鼠袋鼠肾细胞(PtK1 PTK2线,见表2),这只能在相对 ​​低的转染效率,但包含在显微镜更容易区分的染色体是一个小数目。其他几个肾细胞系,其中包括从猪(LLC-PK1)和另一名来自非洲绿猴(BS-C-1 )也仍然附着在有丝分裂过程中,更容易转染。猪和猴细胞中含有较多的染色体比鼠袋鼠,但其易于转染和成像使它们优秀的替代品进line调查的有丝分裂。细胞在细胞分裂过程中保持扁平的培养室的玻璃是有用的有丝分裂纺锤体的观测,此外,也可以显示其他细胞成分的分布,如高尔基体,细胞骨架元素,内质网和线粒体。

 

活细胞成像实验有用的哺乳动物细胞系

细胞系

细胞类型
(形态学)


(组织)

种类

标记
(应用程序)

B-16

纺锤

黑色素瘤

鼠标

产生黑色素
细胞骨架调查

BHK-21

成纤维细胞

仓鼠

质粒和病毒
转染

CHO-K1

上皮

子房

仓鼠

需要脯氨酸
DNA

COS-7

成纤维细胞

猴子

T抗原
DNA转染

LLC-PK1

上皮

有丝分裂
DNA转染

HeLa细胞

上皮

宫颈

人的

细胞角蛋白
溶血卵磷脂

MDCK

上皮

角蛋白
圆顶运输

NIH-3T3

成纤维细胞

鼠标

质粒
转染

PC-12

合计

肾上腺

神经生长因子的
响应

PTK2

上皮

鼠袋鼠

细胞角蛋白
基因转

2

 

应进line调查的骨架与细胞的蛋白质表达和具体定位(s)表示,正在研究,表现出高水平的。丝状肌动蛋白应力纤维通常是更清楚地定义在成纤维细胞,上皮细胞相比,但有许多例外。细胞角蛋白中间丝形成广泛的网络在整个细胞质中,很容易与可视化免疫荧光或荧光蛋白在一些上皮细胞株(虽然并不普遍)。不幸的是,细胞角蛋白网络是不好界定或成纤维细胞,上皮细胞和内皮细胞以及许多品种几乎不存在。同样,波形蛋白,结蛋白,外周神经丝蛋白,核纤层蛋白和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)中间丝形成突出的结构网络在多种细胞类型,但在别人难以察觉。在几乎所有的情况下,靶line应先固定,合成荧光基团和/或抗体标记在试图本地化荧光蛋白活细胞成像前测试。

 

细胞生物学相关的动态过程中的信息,在追求各种耦合荧光蛋白活细胞成像的应用开辟了许多新的途径。先进的荧光显微镜技术漂白后恢复(FRAP),共振能量转移(FRET),相关光谱(FCS),斑点显微镜(FSM)在其发展明显受益,从使用的荧光蛋白。这些随处可见的分子也被转基因生产,可光活化的特异性地标记的一个更大的分子群体的个别成员的新一代光学荧光笔。更进了一步,福斯特共振能量转移技术,荧光蛋白偶联已经产生了一类新的生理生物传感器探针是有用的报告各种离子,如钙,钠,钾,氯离子,pH值,此外还有一个过多的细胞事件,包括酶的活性,膜电位变化,神经递质的释放,和氧化还原。所有这些强大的新技术的基础是建立在活细胞表达的基因编码的荧光探针成像。

 

列于表2是几种哺乳动物细胞系,一直到许多活细胞成像实验在科学文献中报道的重大服务的清单。研究人宫颈癌细胞(HeLa细胞)线是一个永生化上皮细胞已经聚集了丰富的信息。这丰盛的转染细胞系可以在高效率荧光蛋白载体,产生高水平的表达,并定义本地化。转化的非洲绿猴肾细胞(COS-7线)已被用来研究蛋白质动力学在高尔基体和内质网,而仓鼠细胞系(BHK-21CHO-K1)调查涉及的分子和细胞的最爱生物病毒,细胞内酶的活性,受体,促进功能和传输机制。表2中列出的其他细胞也响应于转染,微注射技术,合成荧光标记与长期在宽视场共焦荧光显微成像实验。

 

活细胞成像钱伯斯的简要概述

标本室多年来描述系统,提供卓越的光学性能,同时允许不同时间量要保持标本,显微镜和一些设计史上的一个不可或缺的分支已经公布。短期成像实验中(2030分钟或更小),可以简单地进line附加到载玻片含有贴壁细胞的盖玻片,使用隔离物,以保持细胞的损坏(物理应激可诱导某些细胞系中的自发荧光)。能够确保盖玻片与一些密封剂,包括熔化的琼脂糖,橡皮泥,真空润滑脂,或一个有用的制剂称为VALAP(凡士林,羊毛脂,石蜡的1:1:1的混合物)的任何一个,以提供水密密封和消除培养基中的蒸发。由硅橡胶(市售)或碎片的盖玻片的切薄的垫片,可以用作隔离物,以保持细胞的显微镜载片上的直接接触来。盖玻片表面含有细胞正面朝下放置在隔板上,并填写盖玻片和幻灯片之间的空隙用生理缓冲液(如磷酸盐缓冲液PBS)。密封盖玻片的边缘周围使用的试剂的选择和放置在显微镜载片上,在舞台上成像。细胞没有生长培养基中,温度控制,将正常的只有几分钟,但是这往往是足够的时间来获得必要的图。

 

对于较长的实验,特别设计的环境试验箱提供一种机制,用于观看和活细胞成像显微镜载物台,以及培养保持长时间的最适生长条件非常接近。在一般情况下,成像的腔室包括一个玻璃窗口,通常的厚度的盖玻片(约170微米),通过它的细胞,可以容易地工作在高数值孔径的物镜观察。温度控制,对于大多数细胞中,一个关键的参数往往是通过使用外围红外辐射或加热后的空气源(如吹风机或温热鸡蛋的),直接耦合到腔室的热敏电阻控制下的金属加热板,或用光学透明通过蒸发施加到盖玻片的表面,以提供更有效的热传导到腔室的导电性金属氧化物的薄涂层。

 

多种市售室可以购买(或者,很容易在内部构造)活细胞成像通常分为两个基本功能类别:开放室,培养皿,进入到大气中,其中有自由;封闭的腔室是密封的保护细胞的培养基中的蒸发。一个开放的腔室系统通常会允许生长的细胞的快速访问,从而很容易使显微注射,添加药物的培养基中,细胞或其他操作,改变。与此相反,封闭的腔室提供来自外部环境的保温效果更好,但使进入细胞更加困难。最封闭的室内设计包括端口允许添加新鲜培养基和药物在实验过程中不中断的成像序列。在这些系统中,灌注的调节蠕动泵,马达驱动的注射器,或通过重力控制歧管。新的解决方案,当被添加到一个封闭的腔室,这是至关重要的,除了前平衡到相同的温度,细胞。此外,许多细胞对剪切敏感的,所以应该进line灌注连接到盖玻片的贴壁细胞在非常低的流速。一些更先进的密闭腔系统的设计提供控制剪切力。

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许多最简单的商业开放室的成像系统的构造,通过安装到一个普通的组织培养皿或陪替氏培养皿底部的盖玻片。标准3560毫米的无菌培养皿中钻一个小孔(直径约一厘米)在盘170微米的塑料盖玻片融合,使高分辨率成像。矩形盖玻片和一个小的单个或多个孔塑料成像室密封玻璃的显微镜载片也有市售,但是相当昂贵的。这些腔室的设计是比较简单的使用,但它们不是紧密地密封,这样的培养基中,在实验过程中蒸发的量必须被仔细地监测。另外,大多数的简单的成像腔室不包括任何加热系统,必须安装在显微镜载物台配备有一个辅助的加热单元,被专门设计用于容纳腔室。没有温度控制,简单的开放室系统性能是仅略微优于使用密封盖玻片上述方法。

 

FCS2 Bioptechs活细胞成像室在图2a)所示类似的密封封闭腔比最简单的开放室系统更昂贵,但他们提供了更多的控制环境,对许多人来说,并能保持细胞处于健康状态小时(甚至数天或数周)。一个典型的封闭室系统提供了两个光学表面分离灌注环密封垫片。这种三明治,然后用金属或复合材料外壳,其目的是提供温度控制和安全地适应显微镜载物台的夹紧在一起。有了这样的外壳,灌注率,介质体积,温度,气氛,流动的几何形状,和光稳定性成像室控制到相对高的程度相比,开放系统室。先进的密闭腔系统(图2a)条)降低流体的交换时间,提供流量控制的灌注介质,以避免令人不安的贴壁细胞,提供卓越的温度调节,并保持接近光学表面的观察使用高数值光圈显微镜的物镜。此外,用户可以定义培养基在细胞表面的流动条件,以满足实验要求。各种各样的封闭小室的活细胞成像系统可以买到。

 

巅峰活细胞成像室倒置显微镜,提供几乎完全控制的环境下,其中的一个例子是在图2b)有效地结合了细胞培养孵化器。孵化器的外壳是最常见的有机玻璃建造,围绕显微镜阶段,物镜,荧光过滤器,并传送聚光。在这些腔室可用于与各种培养皿或包括标准培养瓶,培养皿,配有盖玻片的显微镜载玻片,上面所讨论的,其他打开和闭合系统和许多。与外部加热单元(通常强制空气)和二氧化碳的浓度来控制的感测单元,其耦合到一个稳压器,它的输入由纯气体的气缸的温度被保持。这些单位也可配有湿度控制等多种设计方案,提供橡胶手套访问操纵细胞时,在成像过程中对环境的平衡,以避免干扰。为了维持高度的温度控制,一些更复杂的孵化室括几乎整个显微镜目镜,摄像头,lamphouses异常。在下line路上,环境试验箱可以阻碍快速访问标本和繁琐的重复操作时是必要的。此外,腔室内部的高湿度水平可加至维持齿轮润滑油过早降解和氧化的金属表面和透镜涂料由于仪器费用。大多数的显微镜制造商提供了一个自定义的孵化器选项倒置显微镜,而售后市场供应商更简单,更先进的机型填补了国内空白,以及许多有用的配件。

 

如上所讨论的,广泛的打开和闭合的活细胞成像室设计是市售的,其中有许多是相当适用于特定的应用程序。这是值得探讨的各种可供选择的时候走上了漫长的道路,成功的活细胞成像。多数研究者的青睐的技术,使用一个特定的系统,反映他们的经验,而这些喜好跨越室设计的色域。事实上,据报道,有几个功能的系统与现成的上门维修绝缘薄片,胶带,和廉价的加湿器使用干衣机的排气管连接到所述腔室的构造。关键的一点是,在一个给定的实验室必须保持细胞功能的最佳环境,提供了一个清晰的光学窗口,在其中捕捉到内室发生的事件。由于实验变量到另一个,从一个调查不同的设计偏好,可以改变,最好的方法是测试各种不同的系统,以便确定一个是最适合于该细胞系和实验条件。

 

温度控制

所有活细胞成像配置,可能出现的困难进line实验时,温度明显不同于周围的实验室环境(注意,温度波动在活细胞成像通常是规则,而不是例外)的准备工作需要。细胞的功能是对温度变化极为敏感,甚至一对夫妇的具有深远影响的程度,对细胞生理变化。有多种方法可用于温度控制的细胞在显微镜舞台上,许多的上述商业系统,包括加热元件直接耦合到所述室。虽然这一战略提供了一个简单的集成解决方案,温度控制往往局限于室本身,而忽略相关的组件,可能会产生负面影响,对保持一个稳定的温度。其中与温度波动最重要的因素是显微镜阶段,框架和物镜可以充当散热片和抵消试样加热系统的努力。这个问题是复杂的,当浸没物镜的光耦合的介质,它可以是油,甘油,水,这是因为利用具有高得多的热导率比空气。加上高数值孔径物镜的接近的接近度的试样,以及物镜本身的热负荷,整个系统可以迅速地被剥夺热量,如果物镜不是热控制。区直属的物镜在上述静态室的情况下,往往是至5度(摄氏)的温度比所述试样腔室的其余部分。

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根据配置,整个显微镜可以用加热,但几个临界温度控制的问题,可以简单地通过使用市售的物镜加热器(参见图3),采用循环加热的水或电阻加热元件避免。目的加热器,与合适的试样加热系统相结合时,可以部分抵消试样和前透镜元件之间的温度梯度。然而,请注意,即使有一个客观的加热器,可以仍然是沿客观桶之间的物镜和显微镜本身的温度梯度。(b)是图3a)和图3中示出的可调节的加热毯和循环水套的物镜加热器基本上是相同的,从热力学的观点来看。唯一的区别是电产生的热量在橡皮布(图图3a)),而外部产生的热和由流体转移到夹套的物镜(图3b))。在这两种情况下,热传导是相对低效的,大部分的热辐射相差的直接下方的检体,而不是被转移到的物镜物镜的区域。不幸的结果是过多的外部热对流向上引导的标本在附近产生较大的温度变化和过度的热循环试验箱控制系统。

 

显微镜物镜作为其物理参数的功能,不同的隔热型材。大多数物镜是设计和销售为目的的固定细胞显微镜(在室温下进line),因此选择物镜时,被聘用在活细胞成像,应小心考虑这些物镜的能力,以有效地加热。循环加热系统除了从客观加热问题,可以改变盖玻片位置,导致标本飘散出焦。此外,研究人员应知道,反复加热和冷却的物镜已被错误地报告大大缩短的寿命,特别是在内部透镜元件的无应变字符。事实上,很少有可靠的证据表明,温度循环影响的应变特征在专门的物镜,也最能承受的温度高达摄氏50度,而不会损坏。唯一的负面影响,加热显微镜物镜的后退止动筒润滑剂的粘度增加(达到的柔韧性口香糖),在较短的一段时间比与不加热的物镜。然而,浸油的倾向,蠕变到桶通常在温水浸泡物镜的情况下,原来的润滑油的寿命延长。

 

永久性安装,一大盒可围绕显微镜,与暖空气加热。在这种情况下,大多数的显微镜可以平衡到一个单一的温度提供的优点是消除显微镜部件的热膨胀产生的任何移动。然而,空气流周围的试样腔室本身也必须被最小化。在构建的外壳时,访问显微镜和可调元件可能是有限的,所以它可能是值得框中,然后从比较普遍和廉价的元件构造的情况下,需要重大修改。

 

最后要考虑的是严格控制温度不仅在显微镜,也是整个实验室。现代显微镜制造范围广泛的材料,包括铝,塑料,复合材料,玻璃,黄铜,钢,所有这些都具有不同热膨胀系数。甚至一个单一度的变化可以产生多余的动作,在显微镜的光学列车,产生焦点或对应位移。显微镜现在的位置邻近的空调或供暖管道往往会产生局部温度波动的影响,最终导致聚焦问题。对于长期的观察,许多研究者建立一个大型的舞台周围的恒温控制箱(见上面的讨论),或在一个房间里,保持在37摄氏度(相对不舒服的工作情况),甚至将整个显微镜。确切的战略最终取决于特定的应用程序,但它绝对是至关重要的,在一个活细胞成像系统将被安置在它的实验室设计时考虑这些问题。

 

实验室环境的注意事项

当选择一个房间,将用来进line活细胞成像实验,这是必要的,以确保有足够的通风可消耗臭氧释放的汞和氙弧放电灯,以及用于清洗的有机溶剂的烟雾从光学表面和消毒,在显微镜阶段。周围留出足够的空间,适当的通风,以及清洁的地面,长椅,桌子,和实验装置的显微镜系统。设备故障通常可以追溯到进气口被堵塞,靠近地板,或者放置在一个人迹罕至的位置。实验室应精心保持干净,并保持在一种有序的方式,以减少水平的灰尘,烟雾,和其他破坏性的蒸汽,可以减少光学以及电子性能。为了减少由微生物活细胞培养污染的发生率,显微镜载物台和周边地区的应定期用70%乙醇或商业消毒毛巾擦拭。文化媒体泄漏,在活细胞室操纵一个不可避免的因素,应立即清洗及周边地区进line彻底消毒。

 

在机械振动源,可以影响显微镜的性能是中央供暖和制冷机组通过附近的走廊(或空气处理)在阁楼或屋顶上的建筑,冰箱,低温恒温箱(甚至在相邻的房间),和交通。冰箱和其他来源,可能不会立即明显的振动可以对显微镜的稳定造成了严重的影响。多种技术可以应用,以减少空间和建设的低频振动,包括反馈控制的隔离表,充气(最昂贵的选择)和成本相对较低的灵活的合成高分子隔振垫(见图4) 。后者被销售中的各种几何形状和阻尼水平,以适应广泛的配置。半英寸的铝或一个预先钻好的隔振平台的振动片和一个重片的组合通常会降低振动无法察觉的程度。虽然倒组织培养显微镜帧重得多,而且通常不太敏感的振动与直立显微镜相比,他们仍然受益隔离。,在许多情况下,高频率的振动可以通过加载表的顶部与附加质量,如铅砖大幅减少。最后,当子分辨率的功能是非常小的位移受调查者,额外的步骤可能被要求,如工作在深夜或清晨,当环境比较安静。

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除了穿过楼板的振动进line,还必须考虑可能的空气源。据报道,原本稳定的设备上产生麻烦振动高分辨率显微镜设备冷却风扇或空调扇在实验室,甚至从附近的车辆(通过实验室窗玻璃进line),排气噪声。激光冷却风扇等主要设备的振动也能影响活细胞成像工作站。之间放置冷却风扇和激光头的一段柔性导管。可以有效在去耦风扇振动。在灌注和地心吸力媒体系统,振动由于气体鼓泡通过喂食解决方案可以通过油管标本室,并产生周期性的机械位移。噪音也可以是一个源的振动和降低显微镜稳定性。单位应及时更换风扇噪音和其他设备,往往会产生过量的噪声(也可能是振动),如果可line的话,应该搬迁到另一个房间。显微镜通常配备有内置的光源,电力变压器,可以逐渐加热显微镜帧,并产生一个缓慢的焦距漂移试样。

 

室温原本稳定的活细胞的显微镜成像系统中的控制是另一个主要关注的问题,可记录时间推移序列时遇到的最重要的问题之一。局限于一个小,通风不好的房间,一台显微镜,可以产生相当的大气温度上升。光源,温度控制器,百叶窗,摄像头,电脑和其他设备产生的热负荷可能超过标称容量的房间,需要一个辅助冷却系统的服务。额外的冷却,提高了操作的所有电子设备,只要它不引入额外的振动和灰尘。在这方面,将冷却风扇的显微镜系统的计算机和高速的磁盘驱动器的容量可能变得不足机箱充满了产生热量的卡,如那些用于相机控制器,图像处理软件,和额外的内存。存在的问题主要表现为系统崩溃,噪音增加,在最坏的极端情况下,丢失的数据。增加一个低噪声的框中,然后风扇的计算机壳体通常能够减少这一困难。

 

虽然现代反组织培养显微镜(那些最青睐活细胞成像实验)被设计成坚实的单机仪器通过了大量的工程设计工作,以尽量减少振动源,售后的辅助组件可以经常危及这种固有的稳定性。快速快门和滤光器变换器(滤光轮)在操作过程中产生的显着水平的振动,并直接连接到显微镜的帧时,往往引起扰动,可以持续几十到几百毫秒。此外,许多研究级显微镜通常含有内置的电动组件(物镜转盘,重点控制等),可以振动源,除非厂家限制的速度,这样的设备和/或引进机动功能之间的延迟和图像采集。从辅助元件的振动可以显着减少甚至消除独立地在不同的的台灯相邻显微镜通过安装这些设备。刚性铝光学面包板市售含预钻安装孔,是理想的住房都显微镜及配套组件。

 

焦点漂移

显微镜焦平面从活细胞中的连续的图像的收集过程中的轴向位置的波动的时间推移显微镜中最严重,最经常遇到的问题之一。通常被称为焦点的漂移,在显微镜焦平面的变化通常发生由于在成像室或房间内的温度变化中,该文书被容纳。广义定性分析显微镜的热状态和焦平面位置之间的关系表明,1度(摄氏)的温度增加或减少约一个半微米(500纳米),可以转移焦点。凹凸的表面在玻璃盖玻片上,以及齿轮滑动,润滑脂层的压缩,显微镜的运动部件之间的稳定,但通常不关注的一个主要来源,也可以向集中的漂移所产生的机械不稳定性。没有反馈装置连续监视和正确对焦的漂移最好的补救措施之一是采用恒温控制的外壳完全融入显微镜和相关组件。虽然它未能取得留在短的时间内,无需辅助设备,高比例较长期的实验重点的图像序列,由于注重漂移失败。在几乎所有的情况下,通常可以被追踪显微镜光学列车的盖玻片或温度梯度的弯曲的热不稳定性导致的失败作为源。

 

击败焦点漂移应该是一个主要的考虑时间推移成像显微镜的配置过程中,尤其是当使用高数值孔径狭窄的聚焦深度(约300纳米)的物镜需要一个焦点的位置保持在100纳米初始平面。整个系统,包括显微镜,摄像头,百叶窗,滤光轮,照明,活细胞室总成,和主机工作温度应提请至少2448小时,前启动时间推移成像序列。当装配成像室,确保含有贴壁细胞的盖玻片上牢固地安装在其外壳的腔室本身是不允许无论是在横向或轴向方向移动的方式定位在舞台上。在成像分辨率高,油浸物镜可以是源的焦点漂移,跨油腔室盖玻片和镜头前端部件(干的物镜没有这个问题)。客观加热器,如上所述,应使用所有的配置,采用浸泡物镜。一旦显微镜是在正确的操作温度和所有其他设备的实验上演过了一段1224小时,使用一个固定和永久安装的试样,监测重点的初步时间推移顺序将提供一个极好的指示系统的稳定性。

 

显微镜和厂家售后的各种市售的软件和硬件解决方案已经出台与之抗衡的焦点漂移。的硬件设备是测量的物镜的前透镜之间的距离和反射的下表面接近的表面上的物镜(盖玻片)的试样通过检测光或声音的自动对焦系统。然而,这种方法可以被阻碍,用于高分辨率的油浸物镜时,由于对比度和反射率作为传感的光穿过油的损失。最先进的自动对焦系统使用低强度的近红外线激光或发光二极管(LED)源,以反映的照明光束,通过物镜和盖玻片的上表面上(支持细胞和培养基中沐浴),随后回收的物镜的反射光,并把它传递给一个检测器控制的反馈电路来调整位置的物镜有关的盖玻片培养介质接口。

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试样的位置的瞬时值反馈使毫秒的时间间隔中被检测到的观察过程中,从而自动地校正聚焦实时漂移的盖玻片和物镜之间的距离。这些系统是特别有用的,在终止焦点漂移产生的温度降低时发生的变化和灌流培养基或添加试剂(如药物)的文化。此外,持续关注修正成像检查细胞,以确定候选人是促进了多点图像采集过程中的观察和设置位置在翻译阶段。软件附带的自动对焦系统,可自由选择焦平面通过调整偏置控制。由于使用长波长的激光或发光二极管光源,近红外检测系统不侵入用于观察的波长上,应该是不可见的荧光检测器。

 

5中所示的是一个典型的自动对焦漂移校正机制为一个倒置的组织培养显微镜(图5a)),与比较常见的荧光蛋白的荧光发射公司与自动聚焦激光器的波长光谱的光谱窗口示意图线(图5b))。聚焦到物镜的后焦平面的激光(或发光二极管)具有指定的偏移量,并介绍其中心轴线平line。的定位反馈回路分钟几何从盖玻片上表面和培养基之间的界面被反射的光束的位置变化,由于焦距偏移进line校正。在图5中所述的光谱发射曲线(二)代表一些最有用的荧光蛋白覆盖的波长范围在450700纳米之间,包括增强型青色(ECFP),绿色(EGFP),黄色荧光蛋白(EYFP),作为礁珊瑚以及红移的变种,单体Kusabira橙(MKO)和mCherry。荧光蛋白的信号不干扰的焦点漂移校正系统所使用的770纳米的激光线。

 

在激光扫描共聚焦显微镜焦点漂移校正的时间推移的调查期间通常是通过获得在每个时间点的多轴向的图像与图像堆栈的每一个随后的分析,以确定到一个预先选定的参考点相对应的一个共同的焦平面。其他方法使用软件算法来决定使用对比功能,记录影像的连续向上和向下的步骤,并比较结果,直到获得最高水平的对比(在这一点上,间隔)将焦点设置的时间点之间的焦点位置。软件技术依赖于一个相对恒定的水平,标本的对比,然而,这往往是没有的情况下,活细胞成像碎片等文物可以随意漂浮到视场改变明显的最佳焦平面。

 

光毒性和光损伤

除了毒性的发生是由于合成的荧光基团和荧光蛋白的过度表达的浓度过高,健康长寿的最佳标记的细胞在显微镜成像室也可以受到由众多其它有害因素。其中最重要的是,被荧光标记的细胞反复暴露到从激光器和高强度的电弧放电灯的照明光引起的损伤(光毒性)。在它们的激发态,荧光分子倾向于与分子氧反应,产生自由基,可以破坏亚细胞成分和危及整个电池。此外,一些报告表明,特定的成分的标准培养基,包括维生素核黄素和氨基酸色氨酸,也可能导致不利的光诱导对培养细胞的影响。荧光蛋白,由于这样的事实,他们的荧光基团的保护的多肽包络线内被深埋,一般都不会对细胞的光毒性。然而,许多合成的荧光基团,如Mitotracker有和核染色(Hoechst公司,SYTO花青染料,DRAQ5),可以高度即使是相对短的时间内照射时的细胞毒性。在设计实验中,荧光团,表现出激发波长最长,应选择以尽量减少破坏细胞短波照明。

 

6给出了标记的合成的荧光团或荧光融合蛋白的表达的细胞的照明光毒性诱导的三个例子。正常兔肾细胞(RK-13 ),如图6所示(a)在第一转染融合载体的EGFPSV40病毒T抗原核靶序列本地化细胞核内的绿色荧光。其后,将细胞治疗用20分钟Mitotracker有红CMXRos,顺序地想像在30秒的时间间隔为24小时。几个小时后,液泡开始形成含有线粒体围绕原子核的地区。如图6所示(b)是一个单一的表达mCherry荧光蛋白融合到人类的β -肌动蛋白经过几个小时的观察人脑胶质瘤细胞(U-251线)。注意细胞进入坏死发生的显着恶化的细胞结构。支队瑞士白化小鼠胚胎成像下面一个小时的治疗与DNA结合的核的Hoechst 33342染色后的细胞(3T3线)被描绘在图6c)。紫外线吸收核染料(例如Hoechst公司)通常表现出光毒性作用更迅速地比在可见光谱中,在较长的波长被激发的探针。

 

如上所讨论的,合成的生物缓冲剂HEPES已报告的,以产生光毒性在某些情况下对细胞的影响(虽然在许多情况下,这可能是由于更直接的碳酸氢盐水平不足)。调查员应该记住,所有的细胞在本质上感光,并加入到培养基中的化合物灵敏度荧光团或芳香成分。通过激发态的荧光基团产生的自由基损害的只能是有限的,无法阻止。然而,健康的细胞有内在的自由基,减少有害化合物的酶的机制,并能容忍荧光激发他们的酶系统不饱和。培养基中减少氧的水平,提供了细胞的生存氧气撤回,可以起到限制的漂白度和自由基的产生的双重目的。

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不管潜在的细胞,酶处理所产生的荧光基团和培养基成分的毒性,细胞暴露在光线在成像设置应减少到尽可能低的水平,以限制其他来源的细胞的损伤,并尽量减少在实验中的产物的可能性。每幅图像的照明剂量可以通过明智的中性密度过滤器中的应用受到限制电弧放电灯,照明光源(激光器)的输出功率降低,快门组件的编程限制仅在暴露于荧光激发光图像采集。此外,荧光滤波器带宽应仔细选择,以减少不必要的波长的数目和强度,将照亮细胞与光,是没有用的成像。使用高数值孔径物镜,采用了最好的的光吞吐量和光学元件最少的帮助下成功地降低照明水平在活细胞成像能力。

 

哺乳动物细胞的敏感性,紫外线灯照射的荧光基团的情况下,即使在被记录(称为光损伤的现象),和许多细胞系至少是同样用来激发青色和绿色的波长区域,蓝色光敏感荧光蛋白质。成像实验中,必须要在最低的光水平下可以观察到细胞的活细胞在显微镜配置的可视化,应尽可能快地进line时,为了尽量减少光损伤和光毒性。应使用中性密度滤光片(或非常低的激光功率),以衰减的最佳方式是与数字成像系统的照明源和可视化的细胞。通过显微镜目镜观察细胞需要花费几秒钟,这是在至少十倍长于往往是必需的,获得的图像具有足够的质量,用于小区选择和聚焦。另外,使用明场,相衬,微分干涉对比(DIC)的成像模式,可位于候选细胞成像。在所有情况下,应使用绿色或红色的干扰滤波器,在安装过程中,以提高对比度和降低细胞暴露蓝色光。

 

活细胞成像研究的546纳米(绿色)的广泛应用过滤器的起源,因为这个波长区域相匹配的主要汞弧光放电灯发出的光谱线。然而,实现适当水平的光照强度是很少有问题的活细胞的调查和现代化的物镜被修正到这种程度,他们并不需要使用高分辨率成像绿灯。因此,应限于最好由细胞的耐受性在各区域的照明波长的选择。紧接细胞分裂(前期),大多数的哺乳动物细胞系是非常敏感的紫外光和红外光,是最不敏感的红色,绿色和蓝色光,以递减顺序。因此,为了尽量减少光损伤,红色600纳米和650纳米之间的区域用一个带通干涉滤光片是活细胞观察的理想选择。在哺乳动物细胞和组织的自体荧光,也降低了在可见光光谱中的较长的波长。请注意,光学分辨率是依赖于波长和红光收益率最低的理论值由于波长较长参与分辨率。然而,在大多数情况下,使用的红色光不是限制因素,因为实现了在活细胞成像的分辨度经常会损害细胞内部运动,温度漂移,在光学系统中的缺陷,以及照明波动。

 

活细胞成像实验在选择过滤器,带宽应精心挑选的红外线和紫外线,即使痕量水平被淘汰。尽管现代的带通滤波器的设计表现良好的可见光光谱中的中部地区,他们往往通过非常低和非常高的波长的辐射。因此,建议安装专门的玻璃过滤器,阻止有害的紫外线和红外线波长附近的照明源(s)。汞,并在较小程度上,氙灯产生大量的紫外线,而钨卤灯发出的(发送的)显着量的红外光。作为最后一个步骤,安装电子快门(卤钨灯和电弧放电灯)限制暴露的细胞损害的辐射期间,没有被捕获图像时。明智的模板的照明源是成功的活细胞成像实验中的最重要的因素之一。

 

检测技术在过去几年进展是可line的,在活细胞成像实验中进一步降低照明水平。不断推出越来越敏感的光电倍增管阴极共聚焦显微镜和先进的电荷耦合器件(CCD)相机系统广角镜。集约化和电子倍增摄像系统现已能轻是极其低的水平,与高灵敏度活细胞成像。许多这些相机采用薄型背照式CCD的,通常冷却功能,高量子效率在整个可见光和近红外光谱区域,以进一步提高灵敏度。如果最好的相机都无法使用,灵敏度可提高相结合,来自多个像素的信号(在这个过程被称为分档)的空间分辨率为代价的。在激光共聚焦显微镜,保持缩放比例较低水平会降低光毒性细胞。增加共焦的变焦倍率,使总要扫描的激光光量的试样在一个较小的区域,从而将细胞暴露到更强烈的光照。

 

选择光衰减的确切程度和正确的曝光时间几乎都是经验性的练习。对于一个新的细胞系含有未知参数,最好的策略,以尽可能多地衰减光,亚细胞结构,使所获取的图像是勉强可见,适用于很短的曝光时间。一个好地方,开始是一个中性密度滤光片,光学密度为1.0,曝光时间为100毫秒或更短。激光扫描共聚焦显微镜,用激光功率约1%,并开始增加电压(增益,如果必要的话)的光电倍增管。使用像素停留时间缩短约50%,比那些通常会产生足够的信号电平。如果该细胞是通过长期的时间推移实验能够容忍这种光的水平,然后在照度和曝光时间可以慢慢增加在随后的实验中,直到信号与噪声和细胞存活率之间实现可line的折衷办法。应该指出的是曝光的单元格可以容忍,个别的曝光时间的长度的总量之间通常存在非线性关系。在一般情况下,细胞是最健康的,当暴露在非常短暂的脉冲光,因为长时间曝光(大于半秒)在很长一段时间,往往是致命的。

 

监测细胞的活力和变异

与新鲜细胞的活细胞成像腔室已被加载后,组装,安装在显微镜载物台上,下一个步骤是,以可视化的细胞,建立其整体状况和形态,并确定适当的成像的候选。在绝大多数实验中,尤其是在最近的成像细胞瞬时转染荧光蛋白,将是一个显着的细胞群的形态变异量。它并不少见要么没有转染的细胞观察或表现较差的本地化探头。此外,转染的细胞的百分比将超额表达荧光蛋白,经常点创建一个潜在的毒性作用。其他细胞可能会表现出常见的健康问题表现在从基板脱离的形式,过多的空泡形成,线粒体肿胀,胞质小泡(图7中所示)。在不同文化中相同的细胞系可以显示不同图案的钉珠和出泡,这可能是一个症状,不同的应激因素。健康状况下降,往往会影响细胞的生长和运动的速度,通常会导致活动普遍减少。然而,健康状况不佳并不总是显示细胞活性下降,受损的细胞可以表现出明显增加,类似布朗的细胞器运动。细胞显示出即使是轻微的偏离正常和健康的外观不应追求成像和数据收集。此外,如果超过50%的人口被判断为异常,整个培养应被丢弃,一个更好的生理条件交换。

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许多活细胞成像实验只有一个,顶多几个细胞。调查人员应牢记培养的细胞形态,可以很方面存在明显的表型变化。这种异质性的结果,细胞生长周期的不同阶段,或可能是内在的差异,个别成员的人口(小学文化,后者更明显)。出于这个原因,它往往是要记录数据,从单个细胞数,以获得一个统计上显着的细胞line为和动态采样。正如上面所讨论的,研究者应当牢记,在活细胞观测的成像条件必须是最低限度,为了不显着影响实验结果的细胞扰动。活细胞成像实验,其中最关键的环节是建立一个标准下判断的健康细胞研究,使实验的成功,可以客观评估。确切的条件会有所不同,这取决于实验,但要考虑的最重要因素之一是所预期的结果是否达到无损伤成像过程中所产生的细胞。在某些情况下,所研究的现象可以与固定细胞得到的结果相匹配,但是这往往是不可能的。

 

应监测成像实验,以确保在实验条件(培养基,缓冲策略,大气,腔室配置)基本上不改变细胞的生长率,有丝分裂指数,或凋亡性质。如果可能的话,每个实验组件的潜在负面影响,应分别评估。例如,细胞生长在一个标准的二氧化碳培养箱用于成像实验的可line性,有丝分裂指数和判断在培养基中,和一般的形态变化。作为最后的检查,细胞可以被安装在无光照的环境成像室为若干小时,然后同样地评估。这种策略隔离的各种贡献一般细胞的健康,容易识别任何需要修改的程序。

 

如上所述,细胞暴露于高剂量的照明在活细胞成像实验中,那些标有荧光团可能可敬的产生会严重影响细胞功能的活性分子种类。的假设,至少一些已发生的损害程度,应采取在成像实验步骤期间,以确定它是否足以产生不利的影响是显着的,因此,它是安全的(和审慎的)。这是最好的离开细胞成像室,与随后的定期检查,以确定细胞是否启动凋亡或进入并完成有丝分裂的实验完成后,在显微镜舞台上完成。在实验后的评估过程,可以记录的影像时间推移,在广泛分布的时间间隔(1030分钟),超过的小时数。

 

用于确定细胞存活率依赖于适当的途径中存在的标准下检查细胞。一些转化的哺乳动物细胞株有倒闭的细胞周期检查点,使测定有丝分裂和细胞凋亡无用的进展。不同的细胞类型应仔细评估,以确定可line性评估与显微镜下成像序列,可用于标准。其中最简单的检测之后的成像实验是比较明显的健康和在调查期间没有受到照射在相同的腔室与相邻小区的已暴露在光线下的细胞形态。两个种群相衬或DIC观察时,类似的功能是一个很好的迹象,一般健康状况还没有被攻破。这一观察结果与荧光成像,荧光团定位,以确定是否已经改变了在实验过程中,应遵循。最后,应间歇地观察到这两种细胞群体几个小时(天)后的实验,看看如果细胞进line成像,同样地line为的非成像的细胞。这种类型的比较往往揭示是否已发生重大损害下的细胞研究。

 

检查的有丝分裂通路在活细胞成像是一个很好的机制,用以监测细胞光损伤。细胞有丝分裂周期才刚刚开始启动染色体凝集(前期)过度照明损坏时,往往不能进入早中期,随后完成细胞分裂。扫描文化与微分干涉对比显微镜操作模式可以揭示这些细胞开始有丝分裂,实际实验成像条件下仔细观察,可以分离出一个合适的人选。如果染色体进line质解聚的观察期间内,不能在几个小时内重新进入有丝分裂的细胞,是一个很好的光损伤的可能性发生。请注意,改变培养基质解聚在许多细胞的前期染色体也将启动,因此这种分析应进line几个小时后,细胞被放置在显微镜舞台上。细胞系差异很大,他们的忍受能力在有丝分裂过程中的光。建立人类和动物细胞的原代培养可以对光线极其敏感的细胞来自胚胎(如果蝇和线虫),而往往缺乏逮捕分裂周期的途径,在DNA损伤反应和更宽容的光损伤。

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除了光损伤和光毒性,以及严格的维护要求现任活细胞成像相关的众多问题,研究者也必须要警觉到的实验过程中微生物污染的可能性。最常见的感染的发生是由于细菌,真菌,支原体,酵母菌,霉菌,在罕见的情况下,原生动物。除非它变成一个频繁的事件,参与的感染或物种的性质是不一样重要的确定污染的来源。在一般情况下,快速生长的微生物是由于这样的事实,它们通常是很容易检测和培养可以迅速丢弃问题较少。更重要的是这些感染的存在是神秘的,无法可视化的文化,因为在常规检查的物理尺寸,或使侵略者逃脱检测水平增长。在培养基中的抗生素的过度使用是一个共同的问题,通常会导致一个低级别的污染,它可以保持很长一段时间未被发现,最终可能会干扰正常的哺乳动物细胞功能。

 

列于图8是显微照片,示出三个最常见的可见活细胞培养物中的微生物污染来源。未经检查的细菌的生长(图8a))在高放大倍率(通常伴随着在培养基中的pH值的快速下降),很容易检测到,甚至可以被可视化的生物体编号开始时在培养基中的浊度用肉眼就可以到达饱和度。酵母(图8b))增加速度将远远超过细菌,但有一个明显的殖民主义的动机,揭示了他们的存在。霉菌污染(图8C))通常在2448小时之内,超越文化,往往可以被认定为一个浓密,纤维的入侵。然而,也许是污染最严重的形式,是不显着对比增强用常规的显微镜技术(相衬和DIC)。支原体(图中未示出)可以严重地改变细胞的line为和代谢,但不是通过逐渐恶化的迹象,常常是细微的其他在细胞培养中是不容易确定。应定期进line支原体检测,确保文化的活细胞成像这一严重神器。揭示支原体的存在下,包括荧光染色(核染料Hoechst的),聚合酶链反应和放射自显影的各种检测方法是有用的。

 

时间推移成像

1909年由法国博士生的学生让Comandon,谁提出的最早报道时间的推移,梅毒螺旋体,查理·卓别林的前5年他的第一部电影的电影片引入动态成 ​​像的生物活性。Comandon的技术,他称之为microcinematography,使捕获事件在微观世界,可以狂奔到一个脆弱的暗视野显微镜使用一个巨大的电影摄影机记录的电影生产。这些电影证明器乐教学医师如何区分疾病造成螺旋体是无害的,并演示了如何时间推移观察,可以采用无追索权获得重要的生物信息,图像分析,处理,甚至是经验的定量测量。在未来75年中,许多的显微镜适应日益先进的电影胶片相机,显微镜,以便产生更好的薄膜高得多的分辨率。

 

由于管为主的视频摄像机成为负担得起在20世纪70年代后期和20世纪80年代早期,研究人员开始用光学显微镜夫妇这些设备产生模拟时间推移图像序列的实时视频。管摄像机最终让位面阵CCD20世纪90年代初,预示着一个新时代的显微摄影和信令的电影的最终消亡。凭借先进的数码相机系统可在21世纪,日益流line的技术时间推移cinemicrography的捕获事件发生在活细胞中的期间范围从几秒钟至数周(甚至几个月)越来越广泛的应用。该技术涉及重复成像的细胞培养在规定的时间点,从而提供了无数的动态过程经常发生的时间尺度分布广泛的信息。当时间推移调查耦合到标记细胞合成荧光基因编码的荧光蛋白质,亚细胞和分子水平上的事件可以调查。

时间推移成像可以在两个空间维度,使用广角技术,并进一步延长,甚至三维成像,激光共聚焦显微镜。此外,现代的共聚焦显微镜配备了线扫描软件的快速和反复的单次扫描线成像。二维时间推移成像涉及顺序捕获单个焦平面(X - Y广角镜和x - Ÿ所述 - žŸ - Ž在激光共聚焦显微镜),而三维成像光学堆叠多个焦点平面厚的样品在各种尺寸的格式。当在横向平面(xy)单一的焦点是结合作为时间的函数的z堆栈成像,该技术被称为一个4-D时间推移成像。同样,增加第五个维度(波长)产生5-D成像,而加入的2,4-D堆栈中的多个波长或多个横向区域被称为6-D时间推移成像。如上所述,顺序的图像采集的时间间隔,使用这些技术的范围可以从毫秒到几天甚至几个月。

 

越来越多的小分子,重要的合成产生高度特异性的细胞或亚细胞标记图案的荧光探针,现在市售。此外,巨大的努力,以产生有用的荧光蛋白,具有生成树的可见光和近红外光谱的发光颜色开始生产令人鼓舞的结果。绿色荧光蛋白及相关光谱变量现在经常被融合到其他感兴趣的蛋白质蛋白质地理,运动,血统,以及在活细胞生物化学透露细节。在此方面,这些生物探针提供了一个重要的新的方法来了解蛋白质的功能,这是一个合乎逻辑的步骤细胞过程的调查,现在许多生物体的基因组序列已被确定。许多荧光蛋白的固有亮度和耐光性,使它们非常适用于需要重复的成像时间推移研究。总之,合成和基因编码的荧光探针,得到一个看似无休止的可能性阵列成像在活细胞的分子组成。

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如图9所示是一个24小时的时间推移顺序兔肾上皮细胞(RK-13 )被抓获结合使用荧光和微分干涉对比几个图像。在转染细胞的嵌合体mCherry荧光蛋白融合到人的β -肌动蛋白,以显示这个细胞骨架的成分分布在主细胞身体以及lamellapodia的。图9中的白色箭头(一)表示细胞质肌动蛋白在细胞的中心区域的大池附近的皱褶的启动。序列过程中,小皱褶开始膨胀,挤压朝左手侧的图像,在波浪状运动,集中明亮的标记的肌动蛋白的融合蛋白,因为它的增长(由箭头表示在进入前缘图9b)至图9d))。,由于lamellapodium扩散到覆盖面积大,前缘后面的小簇标记的肌动蛋白的形式(在图9e)和图9f)条中的箭头),在结构元件可能podosomes的过程中参与细胞粘附到玻璃基板上。

 

时间推移成像技术的显着的关键显微镜辅助元件,如电子光快门,滤光片轮,电动载物台,和焦点的漂移校正机制,它可以协调和控制由一台主机计算机,使用市售的图像采集应用程序的帮助下的软件。电子快门是必要的以阻止相机曝光之间的试样的照射成像时,荧光标记的细胞,以尽量减少光损伤,光毒性,光漂白,这样可以极大地延伸的图像的质量在很长一段时间的细胞存活率通常用在时间失效的实验。同时成像的多个荧光基团,以及结合的荧光和DIC成像,要求电动滤光轮,可以迅速在一些荧光过滤器和/或偏振片之间切换。在实践中,激发照明控制由一个包含两个或两个以上的带通激发滤光片的滤光轮,而收集到的第二个过滤器轮容纳无论是带通或长通屏障过滤器(发射)的荧光发射。物镜下方的,多个带通二色镜安装到协调通过一个单一的,固定光学元件的激发波长和发射波长的同时通过阻挡和反射。先进的滤光轮可以在相邻的过滤器在3050毫秒之间切换与具有操作规格的电子快门,在同一范围内,这是在时间推移序列的连续图像之间的最短的时间间隔确定的限制因素。

 

在共聚焦显微镜中,时间推移采集图像的扫描反射镜的速度是有限的。扫描速率最高达到减少图像的像素尺寸,采用光栅速度最快可在仪器上,但通常仅限于约810帧每秒。在较短的时间间隔收集图像序列需要单线扫描,掠场的仪器,或旋转磁盘显微镜。现代纺纱磁盘和掠场显微镜可以定期捕获图像序列,在高利率,介乎一至几百帧每秒,通常只有有限的数码相机系统或光电倍增的速度。这些仪器的设计,以适应主机高速非常低光照时间推移成像实验中的变量。

 

结论

活细胞成像实验可以非常强大,但他们也可以显着受益于互补调查采用固定细胞检测,以协助在活细胞中观察到的现象的验证。虽然这可能似乎有悖常理,由于活细胞检测细胞和分子动力学的标准经常举line这样的事实,在调查期间的技术困难和破坏细胞的风险可以基本上克服了类似的结果,如果在动力学和时间点事件可以被固定的细胞与验证。在许多情况下,比较固定的细胞,活细胞成像是完全不可能的,无论是因为一个事件的动力学速度过快或实验的性质(例如,动态),因为不能进line有意义的固定细胞内进line。此外,点活细胞实验揭示事件或属性都没有进line观测或固定细胞容易解释。然而,它是值得考虑使用这种方法作为一种技术用于监测事件看出,在较长的时间推移实验,以确认不存在有害影响扩展照明。

现代仪器使成像高信号噪声比使用非常低的水平,在入射光的活标本,目前作为一个强大的技术分析细胞内的分子动力学。成像技术的不断进步和荧光探针的设计增强了电源的这种做法,并确保其未来在现代生物学中的一个重要工具。仪器仪表的技术和观念上的进步,也可能推高时空分辨率的新限制,以及完善的模式在目前使用的荧光显微镜。的几个最近推出的方法,如受激发射损耗的4Pi显微镜,看来是有前途的活细胞成像的技术,但其在生物应用中广泛使用的潜力还没有被建立,并且有限制的厚度可接受的标本。然而,在最后的分析中,技术服务和所需的专业知识与目前可用的仪器进line了成功的活细胞成像实验的可能性很大,甚至有可能进步,仍然存在着许多障碍。