设为首页 | 添加收藏 |sitemap |百度地图 |
货真价实 坦诚无欺
新闻资讯

奥林巴斯显微镜:斜照明的介绍

2013-10-16  发布者:admin 

任何谁曾经考察了硬币,明亮的光线直接观察该救济的硬币表面上是很难看到这些照明条件下,由于从表面的镜面反射的硬币。另一方面,当入射光被布置在低掠射角“打击”的硬币的一侧上和亮度,由此产生的阴影效果的另一侧(更靠近光)引起的硬币的浮雕详细地站出来在三维的清晰度。

oblique figure1

外观有点类似研究微观标本时,一个经典的技术被称为照明(有时称为作为anaxial照明“)。直接受限制的光的聚光光锥到一个单一的方位角允许只从一侧照射试样,如在图1中示出。净效应是伪救济透露细节,否则几乎看不见,无色的标本。斜复合透射光显微镜照明的典型配置如图1所示。下方的聚光透镜系统中定位一个不透明的光具有小的狭缝(或扇区停止),被删除的显微镜的中心光轴停止。从源通通过狭缝,并随后通过系统从一个单一的方位角是离轴的聚光透镜元件的照明光。斜光线,然后从一个非常具体的角度照射试样的一侧上,通过前透镜元件的开口的边缘附近(非常接近的透镜架),并进入显微镜物镜。集中的光线会聚在物镜的后侧焦点面,并且被定向到显微镜中间图像平面,在那里他们通过目镜观察。

斜照明已被移动到的位置的周边内的物镜孔径(用目镜望远镜或聚焦在物镜的后焦平面的勃氏镜,可以观察到这种效果)所造成的零阶。斜光的结果是把零阶光通过一个周侧的物镜前透镜元件从中心向试样。这种转变的零阶的单面使一个或多个附加的衍射光的阶数越高,要包含在物镜的后焦平面的图像的形成作出贡献。只有衍射零阶(通常称为边带)的单面订单被录取的物镜和衍射订单在另一侧,因为倾角照明,完全错过物镜。这个概念示于图2,利用光线追迹和一个简单的透镜来表示的显微镜的物镜。

oblique figure2

一般情况下,透明的标本时,在透射明视场显微术,具有平行束的光线照射时,所产生的图像的可见性差,没有任何显着程度的对比度。这是因为衍射的光的总和,由试样的每一个细节的相位与当两者都在图像平面的复合试样的直接光通过四分之一波长。然而,从每个试样点发出的衍射光包含边带(参见图2)的任一侧上的零阶不偏离的光,这偏离四分之一波由边缘位移。如果一个边带的衍射光被阻止到达图像平面之间将发生的剩余的边带和直接的光以产生一个可见的图像在中间像平面的显微镜,和相消干涉。斜照明是一个极好的机制,以实现所需的图像形成过程中的边带抑制。

在图2中,最上面的光线追迹的系统识别为一个标准的明场配置通过试样进入显微镜的光学系统的轴向光线的途径。对称分量的衍射光被录取的物镜和生产无显着干扰(无论是建设性或破坏性)的免费模式直接在图像平面上的光元件,导致图像对比度和能见度较差。的衍射分量的边带的斜光(较低的光线追迹图2中的系统)中,有几个不捕获由物镜,但至少有一个高阶分量与零阶(二阶边带一起被承认(D-( - 2) )不包含在图中的物镜的后焦平面的清晰度增加的插图)。在图像平面的干扰产生一个图像的检体具有显着更高的对比度和可见性。上面的物镜的轴向和斜光的后侧焦点面的衍射峰的外观也显示在图中。由于只有两个极大值图像形成所必需的,斜光将产生一个可见的图像。

斜照明是能够解决非常精细的标本很难区分使用传统的明场技术的细节,那就是。当斜光射线撞击角ob 物镜的前镜头的显微镜的光学轴,和聚光镜的前透镜和物镜之间的介质的折射率是n,分辨率,照射波长(λ)之间的关系,并折射率可以被描述为

分辨率(D) = λ/(n • sin (ob)) + 数值孔径 (NA)

一些作者等同的术语• sin (ob)的数值孔径的照明,但是这是一个误导的,因为方程并不打算意味着充分地从所有方位发出的光锥,但仅限于所产生的光的束anaxial从一个单一的方位角的照明。标本细节的情况下,零阶未衍射和第一级衍射边带光分开的距离等于物镜孔径的直径是如此的精细,分辨力高两倍,观察到的轴向透射照明和被表示为等式

分辨率(D=λ/2NA

光学显微镜,以符合上述方程(利用斜光时)所需的条件,使得试样周期性的细节的物镜的分辨能力是有限的。在许多情况下,标本信息利用明照明解决如此严重缺乏对比度,几乎可以可视化或成像。的斜光观察标本的净结果是通常分辨率的增加(超过中得到一个封闭的聚光镜明照明孔径光阑),并在图像中的阴影,浮雕状伪三维外观的生产标本。

斜照明技术是各种各样的未染色的物体,如活细胞,晶体,硅藻,和类似的透明或半透明的标本成像的理想选择。然而,由此产生的图像必须被视为谨慎解释,因为从一个侧面衍射订单无助于形成图像。潜在的错误图像中出现的结构可以严重限制斜光检查和定量地描述了以前观测到的标本细节的实用性。这一事实应始终考虑的斜光观察标本时。

oblique figure3

可以通过各种技术实现的必要条件,这已被提高试样的可见性,因为黎明显微镜的斜光,用一个简单的透射光学显微镜。也许最简单的方法是,以抵消聚光镜的局部封闭的可变光阑的图像的光源。前几年,一些显微镜配备有聚光镜具有偏心孔径光阑(如图3中所示,聚光镜的透镜系统,注意,不应该被从显微镜光轴的中心位移)。该装置被设计,以允许整个虹膜移动至关闭光阑开口的圆形偏离中心在一个水平面上,这样将导致在零阶移动到的物镜的后侧焦点面的外周。在高级模型中,整个膜片显微镜的轴线为中心转动的方式,使斜光可以朝向将试样从任何方位,以达到最佳的预期的效果,对于一个给定的试样。

在实践中,利用半封闭的聚光镜虹膜式光圈技术,实现斜照明是那些阻碍了明场观察的类似问题的困扰。结果是普遍亏损的分辨率和叠加的衍射环,环绕着混淆分钟标本细节的解释。此外,源自贝克线和其它不希望的光学效果的试样中所没有的确切的重点复杂图像区域。为了规避许多这些问题,已被用作一种有效的方法相结合的大聚光镜的数值孔径的斜光,耦合到视频对比度增强,产生强烈类似于微分干涉差显微镜(DIC)与所观察到的光学薄膜部。

oblique figure4

可以被配置通过偏心聚光镜光圈虽然斜光显微镜制造商目前出售的聚光镜,大多数不具备这种能力。另一项技术涉及从显微镜光轴的钨灯丝的横向位移,如在图4中示出。在图4中的图(a)是一个集中的长丝,已经被翻译灯箱显微镜的后部的灯的位置调整到右侧的图像。当扩散过滤器被插入到光路(图4b)条)时,光被扩散到具有正确的方向与倾斜的方法观察的照明用渐变填充聚光镜光圈。优化灰色色调可以实现的,在大多数情况下,通过放置在一个位置,以覆盖大约一半的聚光镜孔径光阑(如在图4中示出)的灯丝图像。然而,细心的的灯丝位置和聚光镜光圈调整,加之扩散屏幕的利用率具有不同的混浊,应允许显微镜的显着度纬度,以微调调制图像的对比度。

oblique figure5

建立不同程度的斜光甲更普遍采用的替代扇区站(图5)是利用较低的聚光镜的透镜元件和孔径光阑位置之下。许多显微镜都配有聚光镜的底部附近的位置的过滤器保持器,用于插入一个扇区停止提供一个理想的位置。在图5中的一些机构停止设计的说明。部门停止在过去,从显微镜制造商提供的,但它们是今天越来越难以找到。然而,简单的停止可以由不透明的纸或纸板的截面切断,以适应过滤器托架,或贴在所述聚光镜的底部。

每个扇区站有一个部分,阻挡光(在图5中的标记的停止),另一个区域,只允许斜光通过(在图5中标记的),照射试样。停止通段的大小往往随物镜的数值孔径,并适当大小的确定在很大程度上是一个实验性的努力,在显微镜的部分以达到最佳的平衡。扇区停止可旋转的过滤器固定器内,从各种角度,或(更方便),一个圆形的旋转阶段,试样旋转360度,以达到预期的倾斜照明效果,可以采用照射试样。这些建议可以作为一个准则,但个别的显微镜聚光镜和扇区停止构造,同时观察试样上的图像效果优化斜光,提高对比度和细节进行最后的调整。

斜光可以显着提高标本的对比,相比传统的明场技术,示出由图6中的数字图像。在图6中的试件(a)是已使用最大对比度调整孔与聚光镜明照明成像的牛动脉细胞。试样很明显,几乎是不可见的,详细是很难区分明照明。与此相反,当试样被照亮时,倾斜使用部门停止聚光镜附近的光圈(图6b)条)下,对比度显着增加,许多细胞的细节,包括核和伪足的位置,成为可见。这种特殊的试样难以成像的对比度增强技术的显微镜(包括相衬,微分干涉对比,暗场,或霍夫曼调制对比度)无关。

一种较为容易的标本图像的小鼠肾脏厚截面图6c)和6D)。在明照明(图6C)),有些标本细节是可见的,但具体的特点是很难区分和整体形象受到严重缺乏对比。利用扇区停止照射试样倾斜相反,产生了显着的改善,如在图6d)图中所示。在这个数码影像分钟标本细节变得可见,这在以前是很难观察到,在明照明。

oblique figure6

当暗视野的技术,在该标本具有高度斜光照明从所有方位相比,非对称的斜光产生图像,其特征是高度依赖于入射角的照明。斜光所产生的图像边缘垂直的方向入射照明可见,在这个意义上是不对称的,而不是位于这个方向平行(或接近)。这个概念是图7中所示的两个试样在不同的方位相对于斜光入射的角度。包括由薄的单晶晶片的铝酸镧,通常采用作为衬底的外延薄膜的钙钛矿得到的相同的视场(旋转90度),图7a)和图7b)中的试样高温超导陶瓷沉积。。这些晶体的孪生阻碍融合的薄膜形成,导致膜的性能有不利影响。在图7a)示出的数字图像生成孪晶域时,晶体取向的斜入射的光的双轴线平行的纵向的伪浮雕。与此相反,当晶体和双轴旋转了90度,因此,它是垂直于入射光线(图7b)),孪生域变得显而易见。这是一个壮观的显示斜光照下的纹理效果观察试样取向限制。

与此类似,但戏剧性的少,得到的结果是,在几个方向角的斜光观察半透明山羊头发标本。当的棒状的发丝的长轴方向平行于入射的斜光(图图7c)),在其中心部分和边缘的毛发纤维的结构的细节被显露出来。此细节不存在时,头发纤维是定向为垂直于照明轴(图7(四)),并且观察到一个显着性差异,在两者之间的取向角的纤维的表观厚度。纤维取向平行于入射照明似乎是远远厚于那些面向垂直于光源。因此,显而易见的是,斜光技术不能可靠地收集通过该方法从图像中产生的忠实的测量数据。

oblique figure7

通过斜照明技术带来的表观立体效果并不代表实际的试样的几何形状或地形,和不应该被用来进行测量试样的尺寸。斜光图像的真正价值是揭示转换的折射率或其它光学路径差,使试样内的形态和内部结构安排,可以更清楚地理解。这项技术可以被应用到多种材料出现明照明几乎看不见的或透明的,不能被污染或其他化学或热处理,以提高对比度。的活的生物体的研究和在体外受精过程,如玻璃或丙烯酸类纤维,化学晶体,和其他未染色的材料,可以促进一个容易控制的倾斜照明系统的利用率。

折光指数测定用斜照明

斜光有时也使用作为贝克的线路测试,以确定是否检体的折射率比周围介质中的较高或较低的替代。如果试样被安装在培养基中,结果从anaxial照度低的折射率,遮光将出现在相反的一侧,从该光入射检体,反之亦然,如在图8中示出。对于这两个图,在图8中,描绘两个大小相等的斜光线进入周围介质的试件通过在同一入射角。在点A上的左手图中,光的传播比在B点在较大面积的试样,使该区域附近的试样上的A点比B点附近的区域出现较暗的。在这些条件下,会出现阴影或试样的一侧比另一侧观察时,通过显微镜的目镜(A'B'在图8的左上部分)的颜色稍深。这是的情况下,当样品的折射率比周围介质高。

oblique figure8

试样具有较低的折射率比周围介质中(图8所示的右手侧)时,会发生相反的效果。在这种情况下,将试样的阴影或黑暗的一面的一侧最接近的斜光机构停止。当检体和周围介质具有相同的折射率,则试样将是透明的(或不可见的),将没有任何的斜光折射效果。这种折射率测定方法的灵敏度是高度依赖于聚光镜焦距,可变光阑的位置,并停止扇区的几何形状(如果使用的话)。在一般情况下,最好的结果是得到的聚光镜时,小心地集中和一个偶数场的照度来实现。

在反射光的斜射照明

反射或入射光斜照明,微分干涉相衬场和暗场技术虽然大部分流离失所者,往往是有用金属等标本在冶金领域的检查。光斜照明的透射和反射的基本配置之间的比较如图9所示。图9a)的图中示出的主要光学轴的轴向(明场),斜场和暗场透射照明。一个简单的透镜模拟显微镜物镜和黄色的箭头表示假设光线要实现所期望的照明模式在各自的角度取向。的角度θ是指到二分之一的物镜的孔径角。沿显微镜光轴的光线代表的轴向照明,而那些躺在之间的轴和极限角θ由物镜前透镜和形式的斜光拍摄。光线入射斜角大于θ不进入的物镜和代表暗场照明。

oblique figure9

列于图9b)中的主光路的反射光或落射照明。轴向(明场)在平行的方向上,以显微镜光轴的垂直照明灯的半反射镜,它是通过物镜系统和到标本反射的反射照明进入。与此相反,斜落射照明反射到样品上安装的物镜的边缘以45度的棱镜或反射镜。这些光线穿过物镜前透镜元件的外周,在倾斜碰撞试样,但被反射,折射和衍射的背面通过物镜。的情况一样,在图9a)中的值θ代表的二分之一,通过该物镜的孔径角轴向和斜光的 ​​所有光线被定向。具有更高的角度的光线代表暗场落射照明,可以来源于外部光源或环形的反射镜或透镜系统周围的物镜。在图9中,示出只有一个成像射线各照明模式,但在现实中,这些光线会在所有方向传播。

斜的反射或落射照明是适用于检验,定期或线性结构的表面上的金属,陶瓷,玻璃,聚合物,和其他不透明的标本。为获得最佳效果,应在90度角观察下的结构的长度方向的定位的方位角的照明。该技术是非常有用的减免了在检查的表面结构(特别是在较低的放大倍率),并可以被用来表明是否在试样表面上的结构是通过确定相对方位角的照明阴影的位置的腔体或突起。在斜反射照明,标本应通过完整的倾斜角度和方位与仪器,以获得最佳的分析研究。如果可能的话,应该旋转的圆形舞台,并且标本通过一个360度的角度旋转,捕捉到所有必要的表面细节。应当指出,因为斜光可产生伪影,例如颜色的条纹和方向对比度的显微镜应的倾斜图像的明照明,然后再尝试解释结果中得到的。

先进的斜低照度技术

斜照明,包括相衬和霍夫曼调制对比度的几个显微技术,利用显微镜的基本光学参数。具体而言,这些方法是基于的事实,聚光镜和物镜孔是在主要的共轭平面,聚光镜孔径所产生的每一个点上的照射光束被衍射的试样以不同的角度(根据它的空间频率)的。另一个基本概念,利用这些技术,是物镜后孔的事实,傅里叶光学显微镜平面。

在霍夫曼调制相衬显微镜,的斜光技术的一个复杂的衍生物,聚光镜光圈配有具有狭缝的狭缝掩模的开口边缘附近的定位。的物镜的后侧焦点面包含,互补的第二掩模,称为一个调制器,它包括三个区域,具有不同程度的透射率。通过聚光镜狭缝的斜光被投射到调制器的中央区域,在此区域中形成图像的狭缝。中央区域的光密度,使进入的光通过调制器发送的区域只有15%的,而较深的(但较小)的区域只有1%的光传送。面积最大的调制器的板包括第三区域,该区域是透明的,并传递基本上所有的入射光(减去丢失,由于反射和吸收的)。因此,调制器的物镜板(掩膜)衰减非衍射的零级光(即通过该区域的15%的传输)由试样衍射的光朝向暗界(1%的透射)而被阻塞。试样相差的黑暗的部门的掩模衍射的光传递不变的,造成的阴影铸态图像在外观上类似的微分干涉对比,从而提高折射率的梯度,或试样中的光程差所产生的。

oblique figure10

与此相关的技术,被称为单边带边缘增强升中试利用一个可调节的半停止在聚光镜的前焦面闭塞的部分聚光镜孔径。位于物镜共轭后侧焦点面甲互补的空间滤波器衰减和控制通过显微镜发送的未衍射光束的相移。的衰减程度和背景(直接波)的相移,相对的光圈遮蔽区域由半停止试样的光散射和衍射的,是可调的。再次用这种技术生成的图像在外观上类似于微分干涉法通过以下方式获得,但单边带的方法,DIC的不同,不要求极化的光学元件,以夹持试样。该系统可以进行调整,以标本中检测到非常微小的相位差,以及在高分辨率下的折射率各向异性。该方法利用了一个事实,即只有一个必须被捕获的两个衍射边带,以获得有关的信息的空间频率中的试样,使人们产生该特定的衍射角。图10中提出的,单边带边缘增强对比度优于提供的其他流行的对比度生成模式提供了一个高空间频率的调制传递函数。

结论

时发生在其边缘照亮显微镜的物镜的光学效果,根据镜头的质量,校正像差,标本的特点有很大的不同。当照明光束落在物镜孔径以外的部分,因为它在斜光,其结果是减少了零级光的强度相对的边带的强度,和物镜孔径的边缘处产生的衍射图案。出于这个原因,在照明锥应限制到小于物镜孔径,以避免衍射的工件(如干涉条纹)。仔细的实验​​与聚光镜的照明方法应确保在限制孔径均匀的照明领域。

有几个优点斜光时相比,微分干涉对比,相位相反的。不混淆的一个标本的固有双折射的斜光图像,是与DIC的情况下,但相了解清楚地观察到在定向阴影的图像从斜光。一个很好的例子是脊椎动物的神经轴突,这是更清楚的斜光,由于其高双折射髓鞘产生过多的对比度DIC成像。此外,设备成本明显比无论是DIC,相衬,或霍夫曼调制对比斜射照明,因为唯一的要求是一个正确配置的明视场显微镜。在某些情况下,斜光技术,使图像的显微镜深入组织层比是可能并发DIC。最后,决议没有妥协过,达到与明视场,可以显着增强和对比度。