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徕卡显微镜:CARS显微镜的简介

2013-10-16  发布者:admin 

共聚焦和多光子成像技术仍然是对生物样品进行复杂的研究方法的首选。这些技术的典型的结构或动态过程可视化生物样品中取决于标本中现有的自体荧光物质或合适的荧光染料的可用性。传统的染色方法的缺点是显而易见的:标签是耗时的,并随着时间的推移的染料漂白。此外,他们失去强度和改变样品。染料往往造成光毒性,损害试样,因此影响的实验结果。CARS(相干反斯托克斯拉曼散射)显微镜是一种无染料的方法,该方法通过显示特征的固有振动,其分子中的对比度的图像结构。至关重要的这种方法的优点是样品仍然几乎不受影响。

7_Plodia-interpunctella

 

三波混频实验

相干反斯托克斯拉曼散射的第一个录音回到上世纪6os,当两个科学实验室的研究人员在福特CARS公司,PD MakerRW特休恩,发表了一篇关于他们的实验。他们只是称他们的作品“三波混频实验”。几乎10年后,在20世纪70年代中间,RF贝格利,AB,斯坦福大学的哈维和RL拜尔表现出优势的CARS,在拉曼光谱和首次申请对生物样品。从那时起,CARS的发展已经是必然的。在1999年,A.宗布什,GR霍尔顿和谢,XS报道关于“振动显微镜使用相干反斯托克斯拉曼散射”,及后Potma的和谢的文章写在2004年“CARS生物学和医学”的相干反斯托克斯拉曼散射技术在生命科学领域已抵达。

同时,在2004年刚刚二十出版物关于CARS的数量增加超过75去年,包括越来越多的应用与生物和医学背景。

 

CARS的物理背景

CARS是一个三阶非线性的过程,涉及的泵光束的频率ω P的频率的斯托克斯束的ω S =2ω p - ω ●后的反斯托克斯频率ω处的信号中产生的相匹配的方向。样品被刺激通过波混频过程。在CARS的振动对比时,将创建的频率差Δω=ω p - ω s之间的泵浦光束和斯托克斯束相干驱动一个特定的化学键和振荡与该键的分子的分子振动的频率等于。

CARS信号被样品中的分子所产生的振动运动。没有外部的标记物是需要得到一个CARS图像。不同类型的分子特征振动能量状态。在适当的(红外线)波长的电磁能量将分子激发到这些国家。为了产生足够的信号噪音以上,造CARS理念填充特征振动状态,首先从基态抽成一个虚拟的状态。这是通过照明用“泵”光束在介质中的波长(ωP)。光子的能量必须是小于从基态到第一激发态的差异。当第二光束(斯托克斯梁)在较长波长(ωS)同时发光,分子被迫从虚拟状态成随意的振动状态。由于泵浦光束是可调的,剩余差额ωΔ=ωP-ωS可以具体地调整到所需的振动能量有关的分子。在本质上,所需的分子人口被转换成振动状态。以可视化的分子,泵束提高E-系统的能量ωP+ωΔ到第二个虚拟的状态。从这里开始,分子被允许返回到基态放松,而能源ωP+ωΔ=ωAS检测到(反斯托克斯束)。这些光子被用于成像。

 

CARS详细过程

Figure-1_

图 1:第1步:发出强烈)光(很多)的分子上创建虚拟状态。此灯将许多分子泵,被称为泵束的(ωP)的。第2步:发出强烈)的光到分子与适当的能量来刺激灭绝”的虚拟状态。这种能量是斯托克斯能量(小于激发)。因此,光的斯托克斯束(ωS)。


Figure-2

图 2:这双照明的后果是人口密集振动子基态的状态,这是非常具体的化学性质。选择调谐调谐泵浦光束。


Figure-3

图 3:为了形象化人口稠密的振动状态,我们使用了泵浦光束为探针分子提升到一个新的虚拟状态。(不需要任何动作,光线仍然是)

 

Figure-4

图 4:分子从这个虚拟的状态放松到基态时,能量大于泵,因而更蓝“比泵,因此被称为”反斯托克斯“。这是检测到的信号。

 

F-CARSE-CARS

CARS信号可以被检测到两个不同的方向:

1.Forward CARSF-CARS),与透射光探测器检测

与精确定义的过滤器设置在检测到信号的相位匹配的方向。F-CARS信号一般都非常强,往往很强烈的非共振背景(来自周边溶剂),可区分清楚的。Forward CARS是适用于薄的样品。

2.Epi CARSE-CARS

如果弱F-CARS信号所掩盖的非共振背景,在向后方向上的检测,从而降低了噪声的图像的对比度可以提高。E-CARS是特别敏感的是小于光波长的焦点的对象。高散射样品时,可以是正方向传播的CARS信号的反向散射,导致强烈的外延信号。

 

什么CARS显微镜?

共聚焦和多光子成像技术,生物样品中典型的结构或动态过程可视化,并依赖于现有的自体荧光物质使试样或提供合适的荧光染料。其结果是,新的染料需要分析生物样品中的未知的和潜在的相关细节。

染色标准的荧光样品往往是费时且昂贵的化学方式,因为他们的行为,并可能影响活细胞的典型特性。此外,染料失去强度和改变样品。往往容易引起光毒性,损害试样,并因此可能影响实验结果。

CARS克服这些缺点的方法所固有的特性。CARS不要求标注,因为它是高度特异性的分子化合物,这是基于振动对比度和化学选择性。至关重要的这种方法的优点是样品仍然几乎不受影响。

CARS,现在新的样本,不能因得不到适当的染料染色。

通过CARS技术集成到共聚焦系统中,常规的显微镜技术的缺点是可以克服的。最新的商业发展的结果,在一个易于使用和高效的为各种各样的生物和非生物样本成像显微镜。两个红外激光束,正是在调整的空间和时间属性产生不同波​​数的辉煌CARS图像。CARS过滤器和非退探测器的一对夫妇的组合允许在向前的(外延)的方向,以及在向后的检测。的二次谐波产生(SHG)的记录可以同时进行。常规和高速扫描仪支持组合视频速率的动态过程以及在高分辨率的形态学研究分析。

 

应用 生物学,食品,化妆品

生物学

8_Plodia-interpunctella-silk-glande073

图 5:食品蛾体内成像(谷螟interpunctella)。此图像显示表面的幼虫丝腺。叠加图像的红色的部分为脂质成分(在2850厘米-1),而绿色的几丁质产生的自体荧光,在波长为1064 nm。示出的幼虫在中间图像顶部的刷毛。物镜HCX IR APO L25x/0.95 0.17 W


7_Plodia-interpunctella

图 6:食品蛾体内成像(谷螟interpunctella)。表面的幼虫丝腺,10倍的放大倍率。叠加层上的图像的左侧显示红色的部分为位于中的绿色区域的图像的右侧上所示的角质层下的脂肪细胞。规律的角质层是由自体荧光成像在波长为1064 nm。长的细丝周围腺体幼虫的表面位于刷毛。图片已采取与816 nm1,064 nm的两个通道。物镜HC PL APO 10x/0.4 CS


CARS_Yeast_cells_2

图 78:在酵母细胞的体内成像。已采取了在两个不同的波数的图像。物镜HCX IR APO L25x/0.95 W 0.17。图7在一个星期的旧培养基:酵母细胞。脂滴是小,由于缺少糖。明亮的蓝色部分是酵母细胞内脂滴(-1 2850厘米)。 


CARS_Yeast_cells_2

图 8:酵母细胞在新鲜培养基中培养了三个多小时。结果表明,有足够的糖,可用于细胞的大脂滴。深蓝色部分所产生的水的3,250 cm -1的波数。


CARS_Drosophila_2

图 9:在果蝇的幼虫果蝇体内成像。脂肪细胞显示为红色,在波数2850厘米-1(在816 nm)。两种不同的结构显示绿色自发荧光(1,064 nm处)长管是气管系统,条纹无论在后台的肌肉。物镜HCX IR APO L25x/0.95 W 0.17


食物

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图 1011:在CARS形象新鲜奶酪(左)和三明治酱(右)看上去非常相似。仔细观察就会发现不同之处:虽然新鲜奶酪有一个具体的一致性三明治酱更加流畅。这可以看出,在这个问题上的红色脂滴在不同的分布。


CARS_Sandwichsauce_02

在更加流畅的夹心酱脂滴均匀地分布在整个图像中,相反,他们都聚集在新鲜奶酪。红脂滴(2,850厘米-1),绿色环保:水(3,250厘米-1)。物镜HCX IR APO L25x/0.95 W 0.17

 

化妆品

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图 1213CARS图像提供不同的化妆用产品属性的信息。左手侧上的图像是从护手霜,右手侧图像示出润肤露一个CARS图像中。


CARS_Softcream

喜欢新鲜奶酪和三明治酱更流畅的的润肤露显示更均匀分布的脂滴比手更大,更不规则的脂滴奶油。