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尼康显微镜:相差显微镜的构造

2013-10-16  发布者:admin 

相差光学元件可以被添加到任意明视野显微镜,提供专门的阶段物镜符合管长度参数,和聚光镜将接受正确的尺寸的环形相环。各大厂商都提供了他们的研究和教学水平的显微镜,在直立和倒置(组织培养)配置相差配件。

phase configuration figure1

典型相差的组件可用于直立尼康显微镜从Eclipse系列研究都说明在图1中,虽然类似的配件也由其他厂商生产。图1中的聚光镜是一种通用的系统设计的应用利用了广泛的放大倍数(2倍和100倍之间),配件数对比增强技术,包括微分干涉相差(DIC),暗场和相差。包含内部相差板的物镜是提供与各种光学矫正因素,范围从简单的消色差透镜和平场复消色差的。此外,相差环板有几个层次环绕眼波衰减产生不同程度的对比度和背景强度。正面和负面的阶段物镜也产生了众多的厂家。

 

以便使聚光镜的环形带与物镜的后焦平面,相差望远镜(图1中所示),可以采用插入一体的显微镜目镜观察筒的相差板。一个完整的阶段附件套件范围的成本从几百到几千元不等,这取决于物镜的修正系数,复杂性和台下聚光光学校正,以及是否相差望远镜。以下各节更详细地描述了这些组件,并提出了指导相差显微镜的配置和调整。

 

聚光镜纤维环设计

相差轮(多个年轮环,是拉丁词)台下聚光利用一个堂堂正正的显微镜,或聚光镜内的炮塔倒置显微镜的照明支柱,必须具体到一个特定的匹配配备一个相应的相差板的物镜。例如,将需要20倍的物镜100x物镜,它们都包含附近的衍射面(后侧焦点面)的相差板,聚光镜的环形通道内具有不同的直径,对应的物镜放大倍率和数值孔径。匹配的聚光镜物镜相差环板,显微镜可以对齐叠加的物镜阶段环环上通过实现相差照明的照明光。

 

相差显微镜流行的万能聚光镜系统的设计的大部分都配有3个或多个可移动的环形隔膜,这是可用于与4倍,10倍,20倍,40倍,60倍,100倍的物镜含有适当的相差板。PH1(或同等学历)聚光镜环,其中包含最小光圈,设计要采用低暗场功耗的10倍和20倍的物镜。中间倍率物镜(40X60X)利用PH2环,而最高权力(和数值孔径)100倍的物镜要求的PH3环的,其中包含的最大光圈。一个专门的聚光镜的环形带(PHL)是利用与低暗场倍率的物镜4倍和5倍)时从光学路径或设计为倒置的组织培养显微镜的长工作距离聚光镜除去聚光镜摆动透镜。

phase configuration figure2

聚光镜的环形带刀片具有一个冲压环的中心具有不同的尺寸(图1和图2中示出)的圆形铝板。冲压操作后,环形盘单位阳极氧化处理及染色,用一台黑色的色素吸收杂散光,确保照明光线穿过纤维环按照定义的途径。被定位在板的中心的中心光停止,而异的大小取决于物镜物镜光圈和放大倍率范围,由三个细长的选项卡,以120度的间隔隔开固定。环形板被按下,或者粘到圆形框架(也可阳极氧化处理和染成黑色的),它被装配成圆形的开口部中的聚光器转盘。

 

现代万能聚光镜系统的炮塔(见图2)通常包含五至八个开放的插槽位置,可以配备环形相差板,DIC诺马斯基的(沃拉斯顿)棱镜板,或暗场光站牌。这些板的基本结构是相似的。暗视野照明停止制造的类似的方式逐步环形隔膜,但该环形带一般是宽,并具有较大的直径,以使高度斜射光的波前通过。与此相反,DIC棱镜切成粘到阳极化的帧,插入到转塔的圆形板。

 

相差聚光镜的环形隔膜板被插入到适当的位置在炮塔和弹簧夹固定到位,炮塔开口的外围内的游乐设施。从弹簧夹的张力迫使环形带的调节螺钉(螺纹销)为中心的环形空间中的光学路径(图3中所示)使用的一组板对。一些制造商提供聚光镜系统专为相差,具有不可分割的环中心系统。这些聚光镜通常有一组可以通过按压每个旋钮的轴的致动,直到其锁定到一个环形带调节螺钉的调节旋钮。后螺钉啮合时,扭动旋钮使操作者相对于的物镜相差板的中心聚光镜的环形带。

phase configuration figure3

每当一个普遍的显微镜聚光镜用于相差观察,操作人员应是若干研究的孔径光阑调节杆的位置,以确保膜片的开度较大比聚光纤维环的直径。事实上,这是一个好主意,要始终打开隔膜相差期间观测到最宽位置。一些制造商提供专为相差的聚光镜,其中有一个弹簧加载的机制时自动打开聚光镜孔径光阑相环旋转到光学通路,但禁用此功能相同聚光镜明场观察。相差实验结束后,可以返回显微镜明视场模式下,根据本发明的物镜的数值孔径调节聚光镜可变光阑开口。

 

可在很宽的频谱范围从基本的阿贝设计(无色差和球面像差校正)高度纠正齐明消色差系统,配备了性能优良的光学校正水平,相差聚光镜。此外,专门的相差聚光镜可具有较长的工作距离(LWD)的光学元件,为直立和倒置显微镜,以允许成像厚血管中的试样。许多研究级倒置显微镜组织培养具有超长工作距离(ELWD聚光镜相年轮非常大的容器中,使观察活细胞。

 

相差配件的规格可以从一个制造商的另一个显着变化,也没有公认的标准相环形隔膜(和物镜相差环板)为数值孔径或放大尺寸。其结果是,从一个显微镜制造商的相差物镜不能通常被耦合到从另一个(反之亦然)的相差聚光镜

 

单环相聚光镜是非常普遍的,在同一时间,但已在很大程度上取代了万能回转头模型。老聚光镜需要删除和插入不同阶段年轮为物镜改变时,繁琐和费时的任务,往往必须重复检查细标本细节时经常在几个倍率。中心定位在一个单一的环形带聚光镜的环形光阑类似的方式完成的,新的,普遍聚光镜。对叶或螺旋弹簧单元聚光镜内的住房,无论是平刃或艾伦型的螺纹销或螺丝是用来按环板。

 

为了适应标准的阿贝,消色力,或齐明台下聚光相差观测,必须建立一种机制,放置或非常靠近聚光镜前焦距(光圈)面的环形隔膜。几种聚光镜模型制作的孔径可变光阑(总是位于焦平面)定位在所述聚光镜的基础上,相邻的槽设计为能接受的相差差板或暗视野照明停止。其他的聚光镜设在壳体的中央区域,这是相对不可访问的辅助元件,例如作为相差环形带的开口面。

 

相差物镜

相差显微镜的设计物镜的最重要的属性是一个专门的相差位于或非常接近的衍射或后侧焦点面的存在下。物镜之间是不可互换的相差差板,并经常永久蚀刻成的内部透镜元件之一。蚀刻环上涂有金属膜的局部吸收,降低暗场了光透射,并且通常是由,使得相差光通过一个四分之一波长的相对于光透过玻璃的其余部分将向前。

phase configuration figure4

4中所示的一个典型的相差物镜甲切去图。插图示出的相差板,被定位在后侧焦点面上。其他部分的物镜是相同的,包括内部镜头​​元件,建设标准的明视场显微镜物镜。校正因素,包括平场消色差,平场消色差,荧光,复消色差相差物镜的范围可以从各大厂商几乎涵盖了完整的域。这些物镜也可与盖玻片校正套环(干燥的高数值孔径物镜)和用于浸渍技术在水,甘油,油。此外,相差物镜生产的,在不同的中性密度和相差差值的相差差板,在正面和负面的相差模式以产生一个广泛的对比度水平。

尼康和其他制造商生产的各种相差物镜(见图5),不同的符号(正或负),范围从相对较低暗场的对比度非常高。正相差,最常见的形式,出现暗光密的部分薄试样的背景下,具有更轻的灰色阴影。负相差标本呈现明亮,但叠加在一个黑暗的背景,类似暗场照明。

 

如图5所示的数字图像记录,可使用目前的尼康的相差物镜证明,得到的对比度变化,,由差板中性密度变化和环绕的波前相差差(或提高)水平的比较。图像从一个固定和安装准备的Zygnema丝状藻类是相同的视场。图5a),图5b)和5(三)比较暗低暗场低暗场,变迹暗相差物镜DLLDLADL,),产生类似程度相对较轻对比灰色的背景。黑暗和光明的介质尼康相差物镜(图5d)和5E))表现出积极和消极的一个中型的灰色背景相差。个别尼康相差物镜的性质在下面讨论。

phase configuration figure5

相差物镜由各种类型的标本的对比得到的程度是复杂的事实,大的波动的折射率和厚度可以制作试样区域内的对比度反转和显着的光散射相差的焦平面。应用于移的相差板(环绕的光的波前衰减)和相差特性(延迟或提前环绕的波阵面)的相差板在相差显微镜观察的结果有很大的影响的吸收材料的密度。下面列出了几个重要的特点,Nikon制造的各种阶段的对比度物镜

 

DL低暗-中等对比度) - DL物镜产生较暗的图像轮廓浅灰色的背景,是典型的用于各种用途相差观察的物镜。这些物镜是提供最强在具有主要从周围介质的折射率差的试样的暗的对比度。DL相差物镜检查细胞和其他半透明的生活材料,是最流行的款式,尤其适合于显微摄影和数字成像。

 

DLL低低-对比度) -类似设计DL物镜的,该DLL系列明照明产生更好的图像,往往是作为一个“通用”的物镜,在显微镜系统,利用多种照明模式,如荧光,DIC ,明场,暗场。“DLL相差物镜产生对比度较低暗场DL物镜,但拥有更高的光传输值,光学矫正,比标准DL对应的数值孔径的。大部分由制造商提供的DLL相差物镜有萤石或复消色差的像差校正水平。

 

ADL(变迹的暗色-中等对比度) -尼康最近推出的变迹相差ADL物镜包含了二次中性密度环环相差环板中央的两边。此外次级环有助于减少不必要的“卤素”常与成像的大颗粒或在相差显微镜的试样的功能(如细胞核,整个细胞和纤维)的影响。变迹的物镜是在平场消色差透镜光学校正和功能类似的到DL物镜系列的对比度水平。

 

DM(中暗-高对比度) - DM物镜产生一个中型的灰色背景上的暗图像轮廓。这些物镜被设计成用于有标本的具有小的相移或细纤维,鞭毛,纤毛,颗粒剂,和非常小的颗粒的折射率的差异,如高的图像的对比度。通常仅限于高倍率物镜具有大数值孔径(萤石和复消色差的),DM相差物镜执行非常薄的样品,但厚标本成像时,经常表现出逆转的对比。

 

BM(中亮-负对比度 -通常被称为负相差,BM物镜一个中型的灰色背景上产生明亮的图像轮廓。BM物镜是理想的细菌鞭毛,纤维蛋白束,分球,以及血液细胞计数的目视检查。

 

为了使显微镜技术能够快速识别相差物镜,许多制造商题重要的规范,例如倍率,数值孔径,管长校正等,在绿色字母上的外筒。绿色的字母数字颜色代码用于区分普通明场,偏光,DIC和荧光的物镜,或者使用另一种颜色的代码或标准的黑色字体相差物镜。此外,相差物镜有铭文桶指示的物镜是专为相差匹配环指定。表1中所述的一些最常遇到的物镜每桶版画。相差的物镜,也可以很容易地识别持有物镜明亮的光线透过玻璃窥视观察中央位置的黑暗阶段环。

 

相差物镜称号

缩写

类型

Phase, PHACO, PC

相差

Ph 1, 2, 3,

相差聚光镜123,等

DLLDLDMADL

低暗低低暗,中暗,变迹低暗
(变迹正相差)

PLPLLPMPH

正,低低正,
正中等的,正高对比度
(正相差对比)

NLNMBMNH

负,中负,
中亮
(负相差)

1

 

6给出了一个典型的系列相差物镜具有增加的数值孔径和放大倍率。作为一般规则,当物镜的数值孔径和放大倍率增加时,相差板的宽度和直径都下降(和聚光镜的环形带的尺寸的增大)。此外,如图6中所示剖切表示正和负的相差板的施工背后的基本概念。正相差板产生暗的对比度而包含部分吸收膜的设计,以减少环绕波阵面的振幅。此外,该板包含设计转向90度(延缓)的衍射光的相差相阻燃材料。负相差板还包含两个相阻燃,部分吸收材料。然而,在这种情况下,两种材料被放置于圆形的相差环,使未衍射环绕的波阵面成为受影响的唯一的物种,衰减和相差滞后90度。

phase configuration figure6

对比度是调制的相差物镜通过不同的相差板的属性,包括金属膜(防反射涂层),相阻燃材料的折射率,和的相差板的厚度的吸收。大多数制造商提供的相差差板是通过真空蒸镀法,在玻璃板上或直接到一个显微镜物镜的透镜内表面的薄的介电和金属膜。电介质膜的作用是把光的相差,而金属膜未衍射的光强度衰减。一些制造商利用多个抗反射涂层与薄膜结合,以减少眩光量和光学系统的杂散光反射回。如果相差板的透镜的表面上不形成,它通常位于附近的物镜衍射平面的连续镜头之间的胶结。的厚度和折射率的电介质,金属,和防反射膜以及水泥的光学,精心选择的,产生所需的相移的相差之间的互补(衍射)和共轭的区域(环绕)板块。在光学术语,改变环绕的光的相差相对于衍射光的相差90度(或正或负)被称为四分之一波长板,因为它们的光程差的影响。

 

相差望远镜

如果聚光镜的环形带,位于台下聚光的前焦面,没有确切固定的相差对准在物镜板(即位于中央位置沿显微镜光轴),相差对比光学系统所提供的对比效果将极大地损害。为了确保正确的显微镜操作,并最大限度地相差效果,物镜的后侧焦点面应与聚光镜的环形带在这里进行检查,以确保正确对准显微镜。这个任务可以通过使用相差望远镜,它可以插入到一个目镜观察管(代替一个正常的目镜),或显微镜,双目或三目镜筒组件内置到一个勃氏镜

phase configuration figure7

相差望远镜,通常也称为作为辅助望远镜显微镜辅助,包括一个简单的两个或三个透镜望远镜(图7中示出)布置成充当一个微型光学系统之间的中间物镜和目镜的组合望远镜和显微镜。相差望远镜的焦距范围从约150毫米到200毫米,使移动设备以集中在物镜上的后侧焦点面,当插入的显微镜目镜观察筒。物镜的焦平面的放大图,清楚地揭示了聚光镜之间的环空和物镜相环被合适地聚焦时的相差望远镜的空间排列。在检视固定的相差环在物镜上,操作者就可以执行到聚光镜的环形带的位置调整对准两个相差观察(参见图8)。

 

设计主要是为了在偏振光下观察或微分干涉相差显微镜往往有伯特兰透镜目镜观察管单元或目镜管和显微镜体之间插入一个中间管被纳入。勃氏镜是较为复杂的比简单的相差望远镜,和作为中继透镜,传输到显微镜中间图像平面位于目镜孔径光阑的物镜的焦平面的图像。因此,物镜的后焦平面(和相差/聚光镜的环形带对应)的勃氏镜与显微镜光学路径插入,可以通过显微镜目镜观察。在大多数显微镜配备有伯特兰透镜,透镜的光学通路的流入和流出旋转,通过目镜管下方的一个小的指轮机构。后来模型显微镜往往伯特兰透镜安装在炮塔一起改变图像的放大倍率的镜头。是用一个小旋钮,伯特兰透镜的位置,以及0或其他一些放大倍率镜头标记的pH调整。

 

相差望远镜和Bertrand镜头必须配备了一种机制,调整焦距,因为物镜的后侧焦点面的位置可以随放大倍数(以及一些其他因素),并在于在不同的高度,在显微镜内。对焦的典型相差望远镜只需通过加捻眼管(参见图7),直到物镜的后侧焦点面,重点突出。以类似的方式,的的大多数现代显微镜的透镜特朗配备的聚焦指轮,在物镜上的相差板,使操作员能够集中伯特兰透镜目镜组合。利用匹配的物镜集(齐焦,具有相同的光学矫正及管长的)时,应保持的后焦平面位置基本上是相同倍率发生变化,从而减少了必须重新调整相差望远镜或勃氏镜。

 

相差显微镜对准

在试图对准显微镜相差观察,仔细检查仪器,以确保所有的物镜包含相差板,并牢牢地固定在物镜转换器。物镜也应该在它们的排列顺序排列的物镜转换器上,从低暗场到高的放大倍率,以尽量减少一个聚光镜之间的环形空间和其他的切换频率。通常情况下,10倍和20倍的物镜,都有一个共同的聚光镜环,40倍和60倍的物镜。高度校正的物镜,如浸油设计的复消色差,往往有相似的数值孔径,并在更宽的范围内的放大倍数(40倍到100倍),利用相同的聚光镜的环形带。低暗场功耗相差对比(4倍和5倍),通常需要摆动镜头聚光镜和一个专门的聚光镜环。

phase configuration figure8

聚光镜的环形板也应被顺序地排列,从较低暗场倍物镜设计用于与环形出发设计了一个以最高的放大率。在一般情况下,在整个放大倍率范围可覆盖三个或四个独立的环形通道内。如果一个普遍的聚光镜,最低暗场放大倍率的环形带(例如,PHLPh1染色体)到明视野插槽的右侧,相邻的插槽中的其他板按顺序定位。通常情况下,试样必须在明检查之前或之后相差观察,所以这个安排将提供一个容易的工作流程。

 

如图8所示的物镜的未对准(图8a)和图8c))的后侧焦点面的图片,和聚光镜的环形带和相差环后已被正确地对准(图8e))。在该图中还示出了通过目镜观察(图8b),图8d)和8f)条),这表明显微镜试样时出现错位(图8中观察时,出现在相应的图像( b)和图8d)),并小心地对准(图8f)条)按程序概述如下。

 

建议采取以下步骤相差显微镜对准。

 

在舞台上放置明亮的染色标本和旋转10X相差物镜的光学通路在明照明模式。聚焦样本,并关闭视场光阑,直到它进入视场边缘。使用聚光镜高度调节旋钮,仓台下聚光,所以个人的视场光阑叶片处于锐聚焦内,使用主聚光镜中心调整旋钮,以确保视场光阑,在视场的中心。仔细检讨显微镜配置,以确保科勒照明已经实现,并且标本是大家关注的焦点。

 

取出染色标本和标本在显微镜舞台上放置一个阶段。物镜试样的情况下,仅具有最小的光程差(和可能是困难的可视化),对准显微镜相差模式中,已知会产生高对比度的标本。聚光器转盘旋转,直到被定位在相应的环形带的光学路径(PH1或相当于10倍的物镜)。检查以确保聚光镜环颜色代码或题字相匹配的物镜。检查聚光镜光圈拨杆的位置,将它移动到最广泛的光圈位置(聚光镜设计相差可以这样做,自动)。

 

如果在显微镜配备有勃氏镜,使用指轮控制摆动透镜到位。另外,删除一个显微镜目镜插入一个阶段望远镜观察筒。

 

虽然通过目镜或相望远镜窥视,调整伯特兰透镜的焦点或望远镜焦点眼管,直到在物镜上形成了鲜明的重点相差环板,明亮的图像之间的重叠的聚光镜环和深色中性密度材料的相差板是显而易见的。在许多情况下,在显微镜将初始对准和环形带的图像,因此无法准确地叠加在相差板的中性密度材料(如在图1中(a)和图1c)所示)。

找到聚光镜环形定心销(或螺钉),该环形带的位置调整用螺丝刀或一对相应的旋钮,直到它是重合的物镜相差板(图1(五))。注意:不要试图定心旋钮(通常位于聚光镜上的安装支架连接到显微镜)与主聚光镜聚光镜的环形带的位置调整。这方面的努力将可能不会达到预期的聚光镜环对齐,肯定会危及的科勒照明条件,先前应该已经成立。

 

聚光镜的环形带的中心,所述环的光通过聚光镜将中性密度材料施加到的物镜相差板,减少纤维环图像的强度衰减。因此,如果中心不当聚光镜的环形带,一个明亮的月牙边缘将出现在的物镜相差板(图1a)和图1c))的中性密度材料相邻。如果图像不符合环内的暗圈相差环板,那么无论是聚光镜物镜不集中焦点(科勒照明是不成立的),或相望远镜(或伯特兰透镜)后焦平面。在某些情况下,即使当相望远镜(或伯特兰透镜)和台下聚光正确对焦,聚光镜环图像模糊和出现的焦点。这可能是由于从试样的低暗场频衍射。如果发生这种情况,从舞台取出试样,并进行显微镜对准。

 

如果聚光镜的环形带的图像显着不同的物镜相差板的尺寸,检查以查看是否错误的环形带板已安装在所述聚光镜(最可能的原因)。另一种可能性,如果高数值孔径的油浸物镜聚光镜前镜头元件的设计是浸渍。在这种情况下,它可能是困难的(或不可能)叠加到聚光镜上的相差板的环形空间之间的聚光透镜的显微镜载片上(和/或物镜和盖玻片之间的)没有一滴油。

 

聚光镜环和物镜相差环板是在正确对齐,图1e)所示的图像应该出现在相望远镜目镜与伯特兰透镜到位。在这一点上,在显微镜相差照明试样的观察而正确的配置。

更换相望远镜的目镜,或旋转伯特兰透镜的光学通路,检查标本。应显示的背景颜色的中性灰色(根据物镜相差板的中性密度)与试样中可见高对比度。

 

一旦相差显微镜已对齐,它一般会保持其中心定位有相当数量的物镜/年轮的变化,但应定期检查,以确保正确对齐。如果在显微镜开始偏离了对齐出现在目镜(或在计算机显示器上),图像会出现越来越多像那些观察明照明。

 

显微镜制造商提供了一个绿色的干涉或吸收滤波器与其辅助相差包,因为滤波器会产生用于原始校准的物镜相差差板具有相同波长的单色光。其结果是,对比度提高,当过滤器被插入到光学路径(通常是在照明聚光透镜和视场光阑)。的大多数商业的相差差板的物镜是产生一个四分之一波长的相移在可见光光谱的绿色(550纳米)的部分。从理论上说,如果利用白光,而不是单色光,干扰灭绝不会是完整的所有颜色,对比度将受到影响。这个限制就显得尤为重要,如果消色差透镜的物镜,这是纠正色差,只能在绿色区域,用于相差观察或记录图像。然而,随着目前的高度校正的萤石和复消色差的物镜,对比度的区别通常是可以忽略不计,因此,无关紧要的。

 

用相差照明成像成功的关键是正确地对准的显微镜,并确保足够薄的试样在显微镜载片上的安装介质内均匀地分布。经常遭受非常厚的标本图像的对焦模糊和难以解释的对比反转工件,可以。如果在相当长的一段时间内利用显微镜,偶尔检查物镜的后侧焦点面,在物镜验证聚光镜的环形带的对应的相差板。