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尼康显微镜:在光学显微镜标本的对比

2013-10-16  发布者:admin 

生物体和类似的透明,未染色标本的高分辨率光学显微镜通常遭受缺乏对比,使这些标本几乎看不见明照明模式。使用的显微镜物镜的全孔径,未染色的标本的图像是非常差的,即使是透明的周期性结构的衍射光栅,对齐的纤维,集成电路副本,如丝状藻类,硅藻。

specimen contrast figure1

 

虽然透明标本通常相互作用的光散射和衍射光束通过诱导相移,这些对象仍然在显微镜看不见的,因为人的眼睛无法检测到不同的阶段。样本,除非是高度着色的染料染色,可为显微镜,唯一的选择是显着减少聚光镜工作的数值孔径,通过关闭可变光阑。然而,这种极端的措施将大大削弱物镜的分辨率。

 

现代显微镜的光学系统,能够生产高清晰度的图像,在高放大倍率,但没有足够的对比度在图像这样的能力是毫无价值的。对比度是不是标本的固有特性,但依赖于相互作用的检体的光耦合到它能够可靠地记录的图像信息用合适的检测器的光学系统的效率。显微镜的光学系统中的图像对比度的控制是取决于几个因素,包括正确的设置的开口的隔膜,光学像差的程度,对比度机制,不同的试样,和检测器的特性的。除了专门的对比增强配件,有几个地点显微镜,使操作员能够调整对比度。的光学系统中最关键的是该字段和聚光镜的孔径光阑设置,但对比度也可以通过改变电子照相机(或传统的乳胶膜)γ,改变视频检测器的放大倍数,在实时图像处理操作,以及标本染色。

 

因为人眼感知的对象在其图像产生的对比度,可能会导致一定程度的混乱,除非有先验知识的光中发生的事件产生图像中的对比度。图1示出了一系列的三个在透射光中包含一个透明的,几乎无色的Zygnema丝状藻类根据不同的对比度模式的相同的视场模式下拍摄的数字图像:明场,相衬和微分干涉对比。三个数字图像显得相当不同,显微镜,因为这些变化,可能会得出不同的结论从每个视场的独立审查。

 

1a)中示出的藻类灯丝,在明视场模式下操作,通过显微镜成像与聚光镜光圈缩小尺寸足以使边缘可见,露出内部的一些细节。虽然绿色叶绿体内的灯丝的肋可以区分,图像一般患有整体上缺乏对比度。一个相同的相位对比光学捕获视场的丝状藻类,在图1b)。请注意,一系列肋,环状结构,似乎是两个组排列的,高对比度的球形形状显露是在图1a)中的叶绿体。在一般情况下,图像显示暗区域所包围的晕,这是一种常见的工件在相衬显微镜。施加通过解Sénarmont补偿的偏置一个小的程度与使用微分干涉显微镜成像图1c)中所示的长丝。试样遮光介绍了在一侧而另一边是明亮,导致的伪三维图像的感知的图像中出现黑暗的补偿结果。图1中的每个视场提供了一个不同的标本图像的解释稍有不同,它只能被破译知识显微镜如何创建这些图像。

 

吸收光(自然地或通过添加合成染料介导的)产生的颜色或不同的试样的亮度对比度的明视野显微镜的制造一直是经典方法。术语“ 对比度是指一个单独的标本细节的能力来加以区分时相比,背景或其他相邻功能。效果,对比度定义为检体图像的光强度之间和相邻的背景,相对于整体的背景强度的差异。试样属性产生的亮度变化,或颜色的差异,产生的光的吸收,反射,空间变化折射率,散射,衍射,双折射,荧光和类似的光学现象。在一般情况下,对比度的测量的最高和最低的图像中的强度之间的关系,可以说是由一个简单的公式:

Percent Contrast = [(Ib - Is)/Ib] x 100

 

I(b)是背景强度和I(s)是试样的强度,对比度被调查的功能。从这个等式中,标本的对比,是指图像中的最高和最低的强度之间的关系,这是显而易见的。如果试样的强度(暗)比背景,对比度被称为为阳性,而比背景亮的标本,显示负的对比度。当标本修改的光谱分布(颜色)的光通过时,它会产生颜色对比度。这类对比试样紧密间隔的周期性结构所产生的白色光的干涉。

specimen contrast figure2

在图2中示出的曲线图标本的对比的背景强度的效果。当背景是很暗的灰度值(I(b) = 0.01;红线),图像强度的变化小,会产生对比度的大变化。通过减轻的背景有点浅灰色(I(b)等于0.10;绿线),图像强度的微小变化,提供了一个有用的对比度范围。在较亮的背景强度(I(b)大于或等于约0.50,蓝线),图像的对比度是相对不敏感的背景强度,并且图像强度大的变化只产生小的增加或减少对比度。

 

在大多数情况下,背景和图像强度的离散值,但在整个视场的变化,从而导致对比度波动。作为一个经验法则,透明标本明照明模式显示约2%至5%的对比,而相位和微分干涉相衬图像可以有15%和20%之间的对比度水平,只是略小于固定和染色标本在明观察到的照明(约25%)。相比暗场和荧光显微镜(对比平均水平的60%和75%,分别),相衬和微分干涉相衬照明生产整体对比度少,但仍然负担相似程度的决议。

 

振幅和相位标本

在本发明的的光学对比度增强技术,透射明场照明的最常用的观察模式,在光学显微镜,尤其是对于固定,染色标本或其他类型的可见光具有高的自然吸收的样品之一。总的来说,的标本容易地成像与明照明被称为振幅对象(或标本),因为照明的波阵面的振幅或强度降低,当光穿过试样。

 

然而,对于许多标本在光学显微镜,尤其是未染色或有生命的物质,对比是如此之差,试样仍基本上是不可见的,而不管其目的是解决或明确分开的细节的能力。通常情况下,为这样的标本,重要的是不改变它们通过杀戮或治疗与化学染料或固定剂。这必然导致的显微镜实验了一百多年,在以尝试提高试样的可见性,并带来了更多的细节,而不改变试样本身的图像对比度增强技术。这是一个常见的​​做法是减少聚光镜推荐的大小以下的孔径光阑,或降低,以增加标本的对比台下聚光。不幸的是,虽然这些演习的确会增加对比,他们也严重降低的分辨率和清晰度。

 

在明照明光源(通常是钨卤素灯)和聚光镜的位置,以填补物镜前孔部分相干光的波阵面是相对于显微镜光轴对称。互动的标本的染色区域的波阵面的幅度在减小,而试样的衍射产生突出的第一级衍射边带,它是180度的相位与通过试样的光通过。在形成图像的过程中,在图像平面与环绕光波的衍射边带干扰和背景上出现亮点,与吸收结构在试样表现出各种颜色和灰度级的色调。然而,当未染色样品的折射率与周围介质(通常简称为环绕),衍射光的波的强度显着降低。此外,赋予由试样放出的衍射波阵面的相位差的相对相位偏移了90度,而不是通常180度,观察到具有高吸收标本。这两种效应相结合,严重地限制了试样的可见性。

 

如上所述,改变透射光的强度的试样称为振幅试样,并在显微镜可以观察到其吸收能力或影响的光的波的振幅的平方成正比的光强度,这是作为一个后果。其他颜色自然或人为化学染料染色的标本,也可以清楚地成像在明照明。这些污渍或自然的颜色吸收的某些部分的白色光通过,其他颜色的透射或反射。通常情况下,污渍相结合,产生对比的颜色。例如,蓝色苏木素染色粉红色的曙红,选择性污渍细胞质细胞核往往是结合。它是一种常见的做法是利用标本上的污渍不容易吸收光线,从而使这种在显微镜可见的图像。

 

与此相反,不吸收光线,而是透明的标本,通过被称为相位对象(或标本)的波阵面产生的相位变化。这些标本几乎是不可见的,图像非常困难的,因为人眼可见光波之间的相对相移的变化不敏感。此外,眼睛无法检测到包含电磁辐射的电场矢量的取向的变化,如偏振效应,。相位标本其特征在于以几种标准,包括它们的形状(通常为圆形或扁平),内部的光散射元件的密度,厚度,和独特的化学或电的结构特性(统称为折射率分组)。厚的样品可以是相对透明的,仅包含少量的光散射元件,或者它们可能包含许多散射元素没有光通过,并呈现有效地不透明的透射照明的试样。这些标本通常被称为反射光的标本。

specimen contrast figure3

 

相位的变化主要是由于检体及其周围介质的厚度和折射率之间的差异。一个典型的例子是活的组织培养细胞,在光照下显得几乎是透明的。当通过一个透明的试样,在不被修改的照明光的波前在明视野显微镜,也不是试样吸收的图象形成的波。如果试样是有点失焦,薄薄的灰度阴影所产生的折射光通过目镜观察。然而,当被合适地聚焦显微镜,一个薄的,透明的标本的图像消失(试样具有显着的厚度继续观察由于折射光从众多的焦平面沿光或z -轴)。

 

入射照明光的振幅和相位标本上的效果在图3中。最上面的正弦波图中显示了一个典型的不受干扰的光波(环绕)不通过标本。通过只通过试样安装介质的原状光波的振幅和波长(具有折射率n)图中所示的(图3a))。当光波输入染色标本周围介质具有相同的折射率(在图3b)所表示的绿色方块),波遇到污渍的吸收减少的幅度作为结果,但它们的相对相位保持不变。然而,当光波输入的标本,其折射率从周围介质中(图图3c))是不同的,振幅不会受到影响,但是,大约90度的相位延迟。在现实中,大多数遇到的标本表现出的振幅和相位的影响(图3d))的组合,产生的事件和新出现的光波的振幅和相位之间的关系的变化。

 

光程差和相位梯度

所经历的事件的波前通过透明标本的光程差和相位梯度利用,充分利用几个流行的对比度增强技术,包括相衬和微分干涉对比。在大多数情况下,入射波前部穿过试样,但不通过周围介质中,或者是稍微超前或滞后,这取决于试样和介质的折射率之间的差。当考虑差成像明照明,试件的作用,在改变波通过的光路长度(有效的相对相移)的透明的相位标本是非常重要的。

 

观察在培养容器中或夹在显微镜载玻片和盖玻片之间的相位标本的大部分是相对平坦的,或板状,如图4中所示为一个假设的试样浸渍在均匀介质中。在该图中,试样的厚度记为变量t和折射率为n(s)。周围介质的折射率为n(m) 。入射光波(黄色箭头)接近的试样,沐浴在其周围介质中,从左侧的速度决定的折射率和厚度的商品通过。

当光从一种介质到另一种(例如,从成一个细胞的细胞质中的水的营养组织培养基),速度改变两种介质的折射率之间的差异。因此,当相干光通过聚焦镜灯丝发射的波的相位标本的厚度t和折射率n(s),波可以是增加或减少速度。如果试样的折射率大于周围介质,波速度降低,而通过试样,随后在相对的相位滞后时,从检体出现。可选地,当周围介质的折射率超过试样,波先进的退出时试样的相。

 

specimen contrast figure4

点亮旅客只通过试样经历的光路(OP)是由该产品的试样的折射率(n(s) )和试样的厚度(t)的。以类似的方式,只能通过遍历周围介质的光波出差的光路距离等于乘以由折射率(× n(m))的介质的厚度。之间的检体及其周围介质中的光程差(OPD)可以表示为:

Optical Path Difference (OPD) = Δ = (t × ns - t × nm) = t × (ns - nm)

 

紧急检体和周围介质中的波阵面之间的位置的差异被称为相移δ)和以弧度为单位,可以定义由下面的公式:

δ=2πΔ/λ

 

其中π是一个常数(3.142),λ是波长的光照射试样。的光程差是两个方面:在折射率(n)的厚度(t)的和之差的商品。在许多情况下的光程差可以是相当大的,即使对象的厚度相当薄。另一方面,当检体和周围介质的折射率是相等的,光程差为零,即使试样的厚度是非常大的。在这种情况下,通过试样的光的行进只是延迟(相位差)相对于周围介质中的光通过的厚度相等。

 

相衬显微镜的设计,以利用检体和周围介质中的各种组件之间的相位差。然而,它不是简单的相位差,这是必要的,而且衍射试样必须发生的相衬显微镜,产生一个合适的图像。通过比较,微分干涉对比依赖于相位的梯度,在经典的伪三维图像的技术被广泛地称为否则透明的标本对比度。

 

相位对象的最常见的形状是一个连续变化的光路或密度,如在图5中所示的半球状的试样。在这个例子中,可以数学近似的相位物体的侧面,通过棱镜的形状,如下面所讨论。被指定在图5中的相位物体的折射率n(s)是周围介质中,n(m) 。激进的几何形状相对象转换只发生在边缘AB(参见图5a)条)。入射光影响的对象AB的平面垂直,而平面波阵面是平行于AB

 

1(图5a)中的圆角相位物体的顶点)的边界基本上平行于入射的波前,而在AB的边界垂直。2区到4是微型棱镜的相位对象(图5b)条)的圆形表面的切线定义的。棱镜的角度订单中的2区域比在区域4,区域4'是相反的。边缘à 衍射是最强的。

specimen contrast figure5

 

因此,多棱镜组成的曲面状或半球状的试样,在试样的相对两侧有以相反的方向定向的棱镜。最陡的棱镜是在赤道上的球形试样,用最少的斜率,而棱镜分别位于顶部和底部。这些微型棱镜组成的光学梯度

OG (Optical Gradient) = Φ α(ns - nm)

中,α是相对于平面波阵面的切线的角度。请注意,光学梯度是两个方面的商品:角(α)的光通过,双方之间的折射率差(n(s) - n(m) )。的光通过棱镜改变方向的角度φ(见图5c)和图5d))。方向的变化可以很大,即使斜率或边界梯度可能是小的,如果大的折射率差。如果是相同的折射率,光波通过透过相位物体unrefracted。离开棱镜的光的方向依赖于相对差之间的相位物体及其周围介质中(n(m) ,参见图5c)和图5d)) (n(s) 的 折射率的。

 

如上所述,舍入的相位对象不断变化的光的梯度,并且每个单独的光学梯度棱镜中创建了一个不同的角度的光的偏转。图5c)示出的偏转方向时,周围介质的折射率大于的相位对象(n(m)n(s) ),图5d)示出的情况正好相反的方向(n(m)<n(s) )。成正比的角度偏转,φ,的切线角度(α)的折射率之差(n(s) - n(m) ),使得 :

tan φ = tan α (ns - nm)

 

对于小角度

φ α (ns - nm)(弧度)

 

要总结棱镜的效果的光学梯度的边界,当相位物体的折射率超过周围介质,然后在每个斜坡的梯度的大小相等的对象在相同的角度偏转。此偏转角依赖于相对折射率差和几何切线角度(α)。当介质的折射率(n(m) )是大于对象(n(s) )的折射率时,偏转相反时,情况正好相反。当没有梯度,不存在光通过偏转。

 

的边缘梯度,以及检体的厚度,无论样品是否大致分类为振幅或相位,影响通过的光的波阵面的折射和衍射角。散射光的只有一小部分在此被捕获的物镜,是一个因素,取决于数值孔径。剩余的散射光,这是不收集,表示标本信息丢失所产生的影像。客观的后侧焦点面上的孔径模仿为衍射光,必须集中在中间像平面进行干扰和形成图像的低通滤波器(影响大试样的详细信息)。因为圆润光滑的表面相标本相对较少或没有衍射网站,他们遭受重大缺乏对比成像时无需的辅助对比度增强光学元件的利益。

 

照度的一致性

当考虑光的方法,以提高标本的对比,它是有用的,考虑检体的各种特性,可以被操纵来创建的强度变化,这将导致使试样可见。一个主要的问题是将被改造成的对象有哪些特点了一套独特的情况下的强度差异。

 

分试样的细节和具有的尺寸近似的成像光的波长衍射或散射光的边缘,提供有一个试样及其周围介质之间的折射率差。折射率,光线通过空气或除以光速的速度通过​​真空对象的速度比经典定义。通过任何材料,因为光的速度是小于光在真空中的速度,折光率始终超过值1.0用显微镜标本。为了解决小对象之间的距离,并重现其形状与合理的保真度,必须被捕获的大角度的衍射光显微镜物镜。

 

物镜收集衍射光(或背离)必须纳入清晰的聚焦在图像平面,以产生标本细节。在图像平面中,包含的衍射光的光波进行与未衍射的光,通过和试样周围的干扰。干扰所产生的图像的质量高度依赖于相干光照射试样,并显着改善图像质量一般通过增加的连贯性。在光学显微镜下,部分聚光镜孔径光阑开口尺寸控制在试样上入射的光的空间相干性。减小光圈大小产生一个更大的空间相干性。

 

照明光波至少是部分相干的试样在图像形成的衍射和干涉的作用是至关重要的,需要在各种形式的干涉光学显微镜,包括相位相反,微分干涉相差(DIC),和偏光。实际上,光波通过试样(环绕或不偏离)和试样的衍射产生相互连贯的字符程度,必须加以保护,使整个显微镜的光学列车和相消干涉,发生在图像平面。

specimen contrast figure6

 

如白炽灯的钨卤素型光学显微镜中常用的,是有显着数量的同相振动的波阵面在灯丝上的原产地从他们的角度的部分相干光源。通过热灯丝产生的合奏,因为每个光子振动若干彼此同相,在一个给定的波阵面内的实际的相干度仅仅是局部的。此外,浪表现出很强的一致性也是有限的距离只有几十波长。其结果是,光波长程的振幅会表现出交替的高和低的状态,波振动相干(同相)和瞬时满分彼此同相,分别。长丝和弧光灯的情况可以比较受激发射的激光源,这是连贯的长距离(成千上万甚至上百万的波长),完全语无伦次的荧光发射产生的荧光标记标本。

 

连贯性的起源是来自于一个事实,即原子内的微观领域中的灯丝强烈互相影响时,它们被激发光子发射点。这些短程效应导致局部同步发射发生在离散捆在整个长丝表面。其结果是,一种含钨的卤化物的白炽灯,或电离的等离子体电弧放电的汞的燃烧器的热丝,可以描述为独立发出光的协调突发微型原子的街区的合奏。个人沿着单一方位由灯丝产生的相干波前被称为光射线或铅笔。科勒照明,聚光透镜(定位后的灯管外壳,但在此之前在显微镜视场光阑,光学路径)形成在台下聚光的前焦面(光圈)的灯丝的图像。该孔随后变成部分相干波阵面,用来照亮物体面中,如在图6中示出试样的来源。

 

对于一个给定的光波入射在试样上(参看图6)中,存在相干关系之间的衍射和非衍射的波阵面(零阶)通过试样。保持这种关系之间的试样和图像平面,光波重组互相干扰。在那个位置,相干波伙伴语无伦次与其他波阵面产生的最终图像。这个重要的概念的基础的光学显微镜的许多形式,但相位和微分干涉对比技术是特别重要的,因为通过和相消干涉的图像形成要求的照明的至少是部分相干的。换言之,必须存在一个明确的相位关系之间的环绕声和衍射的光波,标本和图像平面之间的这种关系必须保留。

 

显微镜长期依赖,降低聚光镜光圈开孔尺寸颗粒和边缘相标本,以提高知名度。振幅对象的对比度,也可以提高由聚光镜孔径适当地调整。小物件,边和粒子将衍射光,无论他们是否属于振幅或相位标本。的衍射光的只有一小部分在此被捕获的物镜(由于数值孔径的限制),而其余没有收集的衍射光表示的图像信息丢失。聚光镜光圈开孔尺寸正确的设置是增强的标本图像对比度和引进衍射文物之间的权衡。后者表现的分辨率损失,衍射环的叠加,以及从在试样中所没有的共同焦点区域的其它不希望的光学效果。随着接近衍射极限,图像对比度被泄露的对象的详细信息变得越来越小,空间频率变高。

 

在光学显微镜下,来自作为照明光的波阵面和被检体之间的相互作用的结果的对比,如何处理离开标本的光,但并不是一个特定试样的固有属性。此外,显着影响调制传递函数(MTF)和对比度产生模式的显微镜标本的对比。调制传递函数是显微镜的能力,从检体的信息传输到图像的定量指标。在一般情况下,图像的对比度降低的试样结构具有较高的空间频率(更细的和更紧密地间隔开的细节),无论显微镜的对比度机制或调制传递函数的。

 

结论

光能够通过多种机制来生成图像的对比度与样品相互作用。这些包括反射的表面,吸收,折射,偏振,荧光,和衍射。显微镜的光学元件和照明模式的物理改性,以及最终的图像通过照相或数字电子技术的操纵,也可以增加对比度。下面的讨论突出各种检体和光之间的相互作用,并审查了一些(见表1)的光学显微镜技术已被开发,以提高标本的对比。表1总结的对比度增强技术(次)给出一个标本和各种材料,研究了同时发射和反射的光镜。此表可作为一个粗略的指南,在光学显微镜接近具体的成像问题。

 

人类的眼睛是非常敏感的检体的振幅和波长中的差异。出于这个原因,许多标本切成非常薄的部分(范围从130微米的厚度),化学染料染色,可以提高对比度,来区分居住于试样的结构。此技术已相当普遍用了几百年的生物标本。染料的选择性吸收光从一个或几个波长,并通过或反映其他所有波长。一个例子是吸收所有的可见光波长的蓝色染料,蓝色,反射和透过样品的异常。的生物试样的内部结构元件往往是染色用的染料,选择性地染色这些元素的混合物,对材料是透明的或染色的,不同的颜色的背景下进行的,增大对比度。

 

这些技术也适用于荧光染料,可用于增加对比度标本中具有高度特异性。由一个或几个波长的可见光或近紫外光激发荧光标本时,他们经常发出较长波长的光,从而成为可见的,或对比,相对于其他对象在外地或在黑暗的背景。

 

对比度增强技术,光学显微镜

标本类型

成像技术

透光

透明标本
相对象
细菌,精子,
在玻璃容器中的细胞,
原生动物,螨,纤维等。

相衬
微分干涉对比(DIC)的
霍夫曼调制对比度
斜照明

光散射物体
硅藻,纤维,毛发,
淡水微生物,
放射虫等。

莱因伯格照明
暗场照明
相衬和DIC

光折射标本
胶体悬浮液
粉和矿物质的
液体

相对比度
色散染色
DIC

振幅标本
染色组织
天然彩棉标本
头发和纤维的
昆虫和海洋藻类

明照明

荧光标本
细胞组织培养中
荧光染色
涂片和价差

荧光照明


熔化和再结晶双折射标本矿物薄切片
液晶
化学品
头发和纤维
骨骼和羽毛

偏光照明

反射光

镜面(反射)表面
薄膜,镜子
金相试样抛光
集成电路

明照明
相衬,DIC 
暗场照明

(非漫反射)表面
薄和厚的薄膜
岩石和矿物
的毛发,纤维,骨
昆虫

明照明
相衬,DIC 
暗场照明

振幅表面特征
染色纤维
弥漫金属试样
复合材料
聚合物

明照明
暗场照明

双折射标本
矿物薄切片
毛发和纤维
的骨头和羽毛
单晶
取向膜

偏光照明

荧光样品
骑警细胞
荧光染色
涂片和价差

荧光照明

1

 

染色标本的对比度增加的早期,但仍目前采用的方法,采用的色彩对比过滤器,雷登漆​​明胶平方(柯达),或在光路中的干涉滤光片。例如,如果有一个红色的染色染色的标本,绿色滤色器将变暗红色区域,从而增加对比度。另一方面,绿色滤色器将减轻任何绿色的染色面积。彩色滤光片是非常有价值的辅助标本的对比,尤其是黑色和白色的显微摄影时是我们的物镜。绿色过滤器是特别有价值的应用与消色差透镜物镜,这是球校正绿灯。此外,在相衬物镜内部的相位板的设计,以延迟或提前特定波长,通常在550纳米附近的(绿光)。

 

活标本和其他相对象,这往往产生不良的图像查看时,在明照明,清晰可见的光,而不是化学意味着霍夫曼调制相衬,对比度和微分干涉对比照明下观察时。这些技术需要特殊的光学元件,显微镜,但通常会产生足够的对比度的图像,以显示试样的结构有关的重要细节。

 

对比度改进的另一个简单的技术,涉及到选择的安装介质,其折射率基本上不同试样。例如,硅藻可被安装在各种对比增强介质,如空气或商业介质苏合香。的折射率差提高对比度这些无色的样本,并呈现其轮廓和标记更加明显。

 

各向异性材料通常表现出两个或两个以上的折射率,因此被称为双折射,或双重折射。其中包括在这一类的标本,矿物晶体(表现出高度的结构对称),纤维,毛发,及广泛的其他生物标本。当光进入光纤(光学轴的轴线以外)非轴的各向异性晶体,它被折射成两条射线偏振光其振动方向彼此成直角定向,并以不同的速度。由此产生的光波的偏振,并能干扰显微镜分析仪中复合时产生双折射的试样是高度着色的,含有显着量的造影图像。

 

当入射的光线照射不透明的表面,它被反映在具体的方式是该表面的地形。非常光滑的表面反射光线相等,这种机制被称为镜面反射的入射光的角度。表面不均匀或弥漫性往往反映在所有可能的角度通过漫反射进入客观的光量减少,导致这种现象称为光。对比度在反射光显微镜,可以提高通过仔细试样的制备。金相样品往往显示出晶粒边界和/或抛光处理,以增加反射的光量进入显微镜的反应性液体和气体腐蚀。污渍,荧光染料,薄膜,金属涂层的形式,也可用于引入反射光显微镜标本的对比度。可以成像双折射标本,使用偏振反射光相和透明的对象通常使用的技术,如反射微分干涉对比度,暗场照明,和Hoffman调制对比度观察的主题。

 

无论显微镜技术产生标本的对比,的三个基本参数,以控制图像质量的分辨率,放大倍率,和对比度。在显微镜的主要功能是增加大小和解决分钟试样的详细信息,但必须完成这一行为与足够的对比度,以使检测器(或传统数字相机或人眼)可见试样。



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