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奥林巴斯显微镜:多光子荧光显微镜简介

2013-10-16  发布者:admin 

多光子荧光显微镜是一种强有力的研究工具,它结合了先进的光学技术,长波长多光子激发激光扫描显微镜捕捉到高分辨率三维图像高度特异性荧光标记标本。

inverted setup

该方法是特别有用的细胞生物学家的努力来研究活体细胞和组织的动态过程,而不会造成显着,往往是致命的,损坏的标本。虽然经典的宽视场荧光显微镜在生物系统中的生化事件通常可以提供亚微米分辨率,该技术是由引起的二次荧光位于焦平面上方和下方的整个区域的背景噪声的灵敏度和空间分辨率的限制。

 

多光子显微镜的激发只发生在一个的衍射有限的显微镜的焦点,提供的能力,以获得三维分辨率光学部分厚的生物标本。个人光学部分获得通过光栅扫描标本在xy平面,一个完整的三维图像是由连续扫描标本在连续的Z位置。多光子荧光的焦点的位置,因为可以精确地确定和控制,是非常有用的,用于探测下方的试样表面的选定区域。的高度局部化的激发能量供应,以尽量减少光漂白的荧光基团连接到试样,并降低光损伤,从而增加了细胞的活力和随后的持续时间的实验,调查活细胞的性质。此外,近红外激发波长的应用程序允许更深入地渗透到生物材料,并减少观察在较短波长的光的散射程度高。这些优势使研究人员能够厚的活组织样本,如脑切片和发育中的胚胎,这将是困难的,如果不是不可能的,与其他光学技术的图像进行实验。

 

在图1所示的是一个典型的配置中使用的多光子荧光显微镜实验。显微镜是一种倒置式的仪表设计,观察活细胞的组织培养和较厚的生物标本沐浴在生理盐水。对于常规的非荧光观察,透射灯箱定位以上的阶段,使标本可视化,通过常规技术,如明场,微分干涉对比,相位相反,和Hoffman调制对比度。虽然没有用的多光子应用中,有35毫米照相机主体连接到该端口,在前面的图1中所示的显微镜,采取与现有的照明来拍摄图像的基础上。显微镜主体的右侧的Ti(钛):蓝宝石模式锁定脉冲激光系统,是由于多光子激发的峰值强度高,但较低的平均功率的优选来源。控制激光是通过位于顶部的激光柜,被接合到显微镜端口策略性地放置的中继反射镜的光波导或直接耦合或者通过光纤耦合的电子单元。在显微镜基地过滤光电倍增管检测系统连接到另一个端口,是一个XY光栅扫描单元,可以迅速偏转聚焦激光束在物镜领域。随附的计算机工作站,可以从光学部分组装三维重建显微镜所收集的数字图像处理和分析。

 

传统的宽视场荧光显微镜困扰的二次荧光远离震源区,这有助于天赋和高背景噪声信号发生,往往掩盖了重要的标本细节。共聚焦显微镜规避了这个问题,在很大程度上,通过针孔孔径,产生薄(小于一微米)unblurred光学部分由深厚的标本内使用拒绝的焦点的背景荧光。多光子荧光显微镜的引入提供了一种新的替代共聚焦显微镜,可通过选择性的激励耦合到检测范围更广泛的选择。不同于传统的共聚焦显微镜中,不需要图1中的显微镜的针孔附近的探测器,发射的荧光信号显着提高的效率达到三维歧视。在过去,所需的多光子激发的脉冲激光系统的高成本和复杂性的技术具有有限的使用,但最近推出的交钥匙激光器和商用多光子系统实现多光子荧光显微镜的方法给出了很多调查。

 

双光子和三光子激发

多光子激发的基本原则,首先描述由玛丽亚Göppert - 梅耶70多年前同时进行她的博士论文研究,但假设不能被证实,直到脉冲红宝石激光器的发明,大约30年后。在高光子密度,可以同时吸收两个光子(介导的虚拟状态)相结合,他们的精力去招惹电子跃迁到激发态的荧光。一个光子的能量是因为它的波长成反比,两个光子的波长大约两倍所需的单光子激发。作为一个例子,两个光子的波长640纳米(红色光)相结合,以激发紫外线吸收在320纳米区域的荧光团(紫外线),这将导致在较长的波长(蓝色或绿色)的荧光发射二次。这种独特的应用装置,较长的波长延伸到红外区域,可以方便地利用激发单量子事件,随后在较低的波长发射的二次辐射的发色团。

macrofocus

每次激发事件的两个光子的要求必须的速率常数,取决于激发光强度的平方。虽然光子不必是相同的波长,以引起多光子激发,大多数实验系统都设计有一个单一的激光源,所以两个光子通常具有窄的波长分布的特定人群的成员。与单光子吸收的情况下,一个给定的荧光基团,将同时吸收两个光子的概率是入射光子的空间和时间之间的重叠的函数。基于这样的假设,每个荧光基团暴露在相同的激光截面的计算表明,光子必须内到达10-18)秒(秒)阿托对方。这种重叠期间的时间尺度是一致的中间虚拟状态的寿命(10-17)秒或0.01 毫微微的第二个)。

 

光子密度高的多光子荧光是必要的,以确保有足够的荧光团的激发水平。事实上,光子的浓度必须是大约一百万次,所需的相等数目的单光子的吸收。这是通过高功率锁模脉冲激光器,脉冲峰值期间产生显着的功率量,但具有足够低,不损坏试样的平均功率。简短,但激烈,由激光器发射的脉冲增加平均在一个恒定的平均入射激光功率电平对于一个给定的荧光基团的双光子吸收的概率。最小的平均激励功率电平降低的单光子吸收的量,这也发生在在激发过程中的试样。这是单光子激发事件而导致的加热和一些荧光实验的过程中发生的光损伤的大多数。

 

典型的脉冲激光配置采用短的工作周期大约100飞秒(10 E-13)秒),重复频率为80100兆赫的多光子荧光实验。此机制允许令人满意的图像采集没有过量的热和光损伤试样。为每个脉冲的时间刻度,而通常被称为超短,仍然是45个数量级不再比双光子吸收的反应时间。单重态激发的双光子脉冲的发色团的人口是在传统的宽视场或共聚焦荧光显微镜得到的相同。因此,二次双光子激发后的荧光发射单光子的实验中观察到的没有区别。甲荧光基团,例如罗丹明,将二次荧光排放相同的宽波长范围内,不管它是否被激发的一个单一或双光子激发事件。

 

三光子激发是将关联的非线性光学吸收的事件,可以发生类似的双光子激发的方式。所不同的是,三光子必须与非法过渡到激发单重态的荧光团同时交互的。三光子激发的一个好处是,成功的吸收只需要一个更大的10倍的浓度比双光子吸收的光子,使得这种技术有吸引力的一些实验。三光子激发能增强z轴的分辨率更大程度比双光子吸收。这是由于同时有三个单个光子的相互作用的要求造成的荧光团激发到一个较小的横截面。在实践中,发出红外光的激光,中心在1050纳米的波长分布能够激发荧光,吸收在紫外区(约350纳米的激发波长的三分之一)。相同的激光可同时激发另一个荧光基团的一半的波长(525纳米),在双标记的生物实验中的一个有用的组合。

 

通过利用较短的近红外波长(720纳米),三光子荧光可以延长进深紫外线的有用的荧光成像范围。激光波长在900700纳米范围内将激发荧光基团吸收在240300纳米的地区,这是几乎无法使用传统的光学显微镜。用玻璃制造的荧光物镜具有非常低的传输波长300纳米以下,但波长较长的红外激光辐射可以很容易地通过三光子激发。

tryptophan

一个共同的芳族氨基酸,色氨酸,单,双和三光子激发,在图3中示意性地示出的。4.5电子伏特单光子电子跃迁激发色氨酸在280纳米与随后的二次荧光发射在348纳米的紫外区域。激发的双光子的机制是通过在580纳米为中心的黄绿色的光,而三光子激发时,会发生在近红外区域中的氨基酸与840纳米的辐射照射。转换雅布隆斯基图中(图3),该虚拟的状态表示由双光子激发和三光子激发了球体的球体。色氨酸具有更强的荧光具有更高的量子产率比其它芳族氨基酸,并且在大多数蛋白质只少量存在。这些属性应该多光子显微镜调查一个极好的工具,使用自体荧光色氨酸残基。即使高阶非线性现象是可能的,包括四光子激发,但这些还没有被应用到生物学研究。

 

双光子荧光显微镜

本地化激发该地区周围多光子显微镜的焦点,原因是它在这里,的光子密度最高的。这种优势从基本的物理原理,由荧光基团的双光子吸收激发光强度的平方的函数的产生。当从一个脉冲激光源的光子聚焦高数值孔径的物镜,他们变得​​更加拥挤,从而增加了两个或更多个同时与一个单一的荧光基团相互作用的概率。光子显微镜焦点集中如此多光子吸收的关键,这是唯一的区域发生明显的激发。的概念,分别在图24,说明宏观和微观水平上的多光子激发。图2示出了夸张的视图的显微镜的物镜的位置的图像培养的细胞在显微镜载玻片和盖玻片。红色激光脉冲穿过的纵向轴线的物镜集中,集中到该图的中心部分中的单元格。

 

在图4中,光子与荧光团的拥挤和互动表现在显微镜焦点。作为红色激光通脉冲通过含有荧光基团的试样(表示为球体的线性三重峰),激发的概率随着脉冲达到的物镜的焦点。被表示为单个光子漫红线定义的激光脉冲的边界分隔成合。一小群被激发震源区的中心定位在图4中的荧光分子同时吸收两个光子,并表现出绿色荧光二次。焦平面以外的发色团会吸收两个光子的概率几乎是零,因为光子的密度不够高,在这一地区。

multi figure4

双光子激发的现象是可能的,这不仅是因为在显微镜焦点附近的荧光基团的空间,而且还因为包含在连续的激光脉冲的光子的时间重叠。如上文所述,发生双光子吸收激发能量在由激光源产生的光子的强度的平方成比例。脉冲激光束的强度下降的焦平面的距离的平方,所以焦区附近的任何地方荧光团的激发概率降低的荧光团的焦平面的距离的四次方。脉冲激光照明锥的尺寸由物镜的数值孔径。因此,电子束强度降低相差的焦点激励光锥的直径的平方成正比。,作为照明锥し上方和下方的聚焦点,荧光团的激发概率随着锥体直径的四次方。出于这个原因,荧光团激发只限于立即周边地区的焦点,它代表了整个样品只有一个非常薄的光学部分。

 

超短激光脉冲持续时间,其测量范围通常从约100飞秒,1皮秒(10 E-1310 E-12)秒),被认为是在宏观方面。然而,在吸收光子事件的时间尺度(飞秒约千分之一)的脉冲实际上是相当长的持续时间。这限制了荧光饱和度,并允许分子足够的时间之前返回到基态脉冲之间激发新一轮的发生。脉冲重复率范围从大约80120兆赫(MHz),它提供了激发瞬间峰值功率高,停留时间平均为10纳秒。因为一个典型的荧光的荧光寿命仅持续几纳秒,人口激分子有足够的时间来放松脉冲之间。相对短的脉冲的占空比(脉冲持续时间脉冲之间的时间)除以平均输入激光功率限制为小于10 mW,值仅稍大,常规的激光扫描共聚焦显微镜的。

 

双光子激发焦平面附近的区域的限制提供了一个显着的优势超过共聚焦显微镜的多光子。荧光共聚焦显微镜的试样在整个被激发,而是由检测器所收集的次级荧光共焦针孔限制物镜焦平面。这供应量减少背景噪音或添加背景噪声的数据从其他焦平面的荧光。与此相反,产生多光子显微镜荧光激发(其后,荧光发射)只在焦平面,消除背景信号和共焦针孔的必要性。如图5所示,每个技术检讨漂白型材共聚焦和多光子显微镜的激励模式之间的显着差异。

multi figure5

如图5所示,光模式,从发生反复扫描一个单一的xy平面在福尔瓦的聚合物薄膜与荧光罗丹明(绿色染色)染色的XZ。在左侧(图图5a)),通过扫描彩色膜,用共聚焦显微镜产生的档案。在扫描的中心的白色矩形表示的焦平面上,通过针孔,由检测器成像。对角线突出的矩形的上部和下部的角落的蓝线代表由激发光光束透过薄膜的光的路径。随着电子束在光栅扫描的薄膜,荧光染料是激发和荧光发射二次。最终,光漂白时,在焦区的暗区所表示的。在扫描共聚焦显微镜(图图5a))的膜中,集成的激发几乎等于整个激发路径上方和下方的焦平面上几乎相等。相反,在xz重复扫描激发轮廓产生的多光子显微镜限制激发光漂白的焦平面上(图5b)条)。类似于在图5a)的情况下,对角的焦平面发出的蓝线划定所采取的路径由激发光到达焦平面。

 

来自本地化激发多光子显微镜带来一些优势。也许最重要的是,可以实现与该技术中,这是相同的一个理想的共聚焦显微镜获得的三维分辨率的高度。此外,由于缺乏以外的焦平面位置的荧光团的吸收,使更多的激发光的穿透试样,达到对焦平面。其结果是显着增加的能力,聚焦束的穿透深度内的试样中,频繁的深度的范围可以用激光共聚焦显微镜观察到的两到三倍之间。

 

正如前面所讨论的,沿着光轴(z方向)的距离的四次方焦点区域以外的多光子吸收的概率下降。当与高数值孔径的物镜(1.4)进行多光子激发的荧光基团的均匀分布,约80%的吸收发生在一个严格定义的空间被称为焦距的体积。本卷的尺寸依赖于物镜的数值孔径,但对于一个典型的的大光圈荧光在近红外波长的目的,这被定义为一个具有横向尺寸为0.3微米,直径1微米的轴向长度的椭球区域。

 

漂白量的显着减少(和相关的光损伤的细胞和组织)示于图5b)对于多光子显微镜基本上小于发生用激光共聚焦显微镜。漂白和光损伤的两种荧光显微镜在研究中的活细胞,组织,和其他生物的最重要的限制。荧光的激发导致促进基态的电子激发单能量状态。从激发态的振动弛豫过程中,有一个概率会发生系间窜越到三重态而不是典型的衰减的单峰态。三重态反应和相对长的寿命,它允许在此条件下的时间的荧光基团反应的活细胞或经过非荧光物种的分子变性或重排。此外,在三重态的激发荧光团可以产生单线态氧,这将相邻的生物分子上的官能团与各种反应。必须激发光穿透标本焦平面上的焦点,大部分这种光过去的重点地区继续传播相当远的距离。因此,人口穿过波束路径的激发的荧光基团,为的是可在宽视场和激光共聚焦显微镜的情况下,将进行了相当数量的光,并产生细胞和组织损伤,可避免与多光子技术。

 

虽然暴露于光诱导的细胞损伤的确切机制了解甚少,已确定,光损伤降低将显着扩展的可行性研究的生物样品的荧光显微镜。暴露于长波长的可见光和近红外光不影响细胞生存力,因此它很可能是与多光子显微镜的损害的大多数来自激发和被限制到焦平面。

 

多光子显微镜探测器

在多光子显微镜,通过二次荧光发射的光子的来源几乎完全从物镜焦平面,消除退扫描检测的要求,并允许更灵活的检测几何。这种增加的通用性,可能会导致相当大的改进相比,激光共聚焦显微镜,荧光检测效率。退扫描检测在一个系统中,由物镜收集的光反射到检测器通过针孔之前,一系列的扫描反射镜的表面的。共焦针孔的产生,同时提高图像的分辨率,探测效率的下降幅度大时,必须采取的试样的较长的曝光入射照明,光损伤的概率增加,光漂白。

 

在某些情况下,它可能是可取申请修改的多光子成像的共焦检测技术(图7)。入侵的室内光线下,可以排除通过使用一个大的共焦针孔,它可以产生横向分辨率信号收集效率的成本略有增加。针孔也可以与小的入口孔,例如雪崩光电二极管或光电光谱仪检测器的利用率。利用多光子成像针孔,应仔细检查后方能实施。由样品发出的光,可以向图像形成的大部分将被阻塞的针孔。这既包括光散焦平面光源于重点区域界限内的位置。出于同样的原因,也将是一个减少的量的荧光收集从试样深处。事实上,当采用共聚焦针孔孔径,增加试样深处的信号衰减将是类似的多光子共聚焦成像。

 

几种检测图案都在图7中,示出了使用光电倍增管(光电倍增管),CCD图像阵列检测器和非光学检测收集的荧光信息。光电倍增管检测器给出在多光子荧光显微镜,有效地与这些设备可以被捕获,因为发射波长较短(紫外线和低波长的可见光)。在图7中的光电倍增管检测器的各种标量之间的主要区别是是否发射的荧光被传递回通过扫描镜(退扫描检测)或通过中继传输透镜放置在一个平面上的共轭物镜后孔径检测器(光电倍增管)。第三个光电倍增管(标有外部检测器)所示的位置到右下的试样,是用来捕捉从检体不通过显微镜光学列车的任何部分的情况下,荧光直接。

multi figure6

由于这一事实,分辨率定义为在多光子激发过程中,由激发的荧光基团发出的光可以被收集,而不使用物镜。事实上,高数值孔径的聚光镜将足以应付累积二次荧光发射检测器的目的。在某些情况下,光检测器被放置高于(或低于,这取决于显微镜配置)试样的区域中,从光学显微镜(图7)中删除。这种检测方案,使短波发射,可能会受到影响,或因低传输通过物镜的利用率。另一种策略是直接从附近的二色性反射镜的反射光从通过转换透镜的后孔径下的检测器(如光电倍增管的整个区域,如上所述)中的物镜收集排放。甲较短的排放路径有利于收集光子的数目,特别是当通过沐浴在盐水中的1020微米的组织成像。虽然后一种方法中,可以采用荧光检测效率最大化,它往往是容易污染室内光。

 

如电荷耦合器件(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)探测器,光电二极管阵列,也可以被用来收集在多光子的实验中(图7)的荧光信息。在此配置中,由样品发出的光被再次反射的分色镜,并直接成像到光电二极管阵列的表面,这是放置在一个平面上共轭的中间像平面。因为分辨率由发射波长比激发波长较短,通常可以使用这种技术获得的横向分辨率的改善。

 

几个非光学检测方案有可能被应用到多光子显微镜,由于在激发过程中的高度的空间定位。其中,光电声检测,用来测量少量吸收,光化学扫描检测,产生离子电流电压钳位细胞的受体分布的图像。

 

在多光子显微镜的分辨率

多光子显微镜的分辨率不超过,实现了用激光共聚焦显微镜,事实上,利用较长的波长(红色到近红外,7001200纳米)的结果,在一个较大的点扩散函数的多光子激发。这转化为横向和轴向分辨率稍微降低。例如,使用的激发波长为700纳米和130的数值孔径的物镜,所观察到的横向分辨率是约0.2微米与相应的轴向分辨率为0.6微米。当耦合到斯托克的偏移大小,这些值的范围可以高达30%,大于在相同的条件下与传统的共聚焦显微镜观察到的分辨率。在实践中,共聚焦分辨率有限针孔孔径,色差,以及不完全对应的光学系统,所有这些都有助于减少共焦和多光子显微镜的分辨率的差异可能会降低。从这次讨论中,很明显,如果结构没有得到充分解决,激光共聚焦显微镜,他们将不加价任何好转(可能会加重病情)成像时多光子激发。

 

收集数字图像或三维空间分辨率的光子进行计数,它是必不可少的区分的焦点,在后台的体积内的荧光发射发生。两个信号之间的分化可以通过工具(用共焦或者多光子仪器)或通过反卷积的三维数据集。的能力区分的焦平面和背景荧光的荧光发射信号背景比(S / B),其中,S的焦平面和乙收集的光子的数量或强度被定义为代表光子从背景(聚焦平面)。在激光共聚焦扫描显微镜,高S / B比值抑制背景信号所产生的共焦针孔。然而,在多光子激发,S / B比本质上是大的,因为很少有激发焦平面之外。多光子和激光共聚焦技术的分辨率之间的计算,可以比执行聚焦计算时考虑一个无限小的针孔。对于这两种技术中,通常是几个数量级大于经典的宽视场荧光显微镜的信号背景比。

 

还有一点要考虑的是,可以利用多光子激发荧光团在低波长紫外区的吸收转换。因为低于约340纳米的光激发荧光基团的能力是有限的共聚焦显微镜,研究者往往利用探针具有更长的波长,用相对较低的分辨率。在危急情况下,在多光子显微镜的分辨率可以提高,并且还通过利用诸如CCD的光电二极管阵列扫描影像中的平面下的空间分辨的检测系统通过限制通过共焦针孔的成像波长。

 

激发特性的荧光基团

荧光小分子多光子实验中应进行的用于单光子调查的相同标准来检验。探针应具有方便的波长,高的量子产率,低的光漂白率,和可能的最低程度的化学和光化学毒性大的吸收截面。荧光团也应该是无显着退化,从所述激光源,能够承受高强度的照明。在大多数情况下,研究者已经利用相同的公共荧光基团的双光子作为标记在宽视场和激光共聚焦荧光显微镜,可广泛用于实验。

 

常见的荧光团的激发光谱的激励模式和入射的光子的波长的函数。由于这种相依性,双光子吸收光谱可以(而且常常)从相应的单光子光谱显着不同。在实验中,大部分已审查的荧光基团,能够以两倍于单光子的最大吸收波长的吸收双光子激发。尽管如此,没有根本的定量预测检查单光子的截​​面简单地通过一个复杂的荧光基团的双光子激发光谱的基础。高度共轭的非对称的分子,这是经常被剥削分子光谱激发态的结构提供信息的单一和双光子激发光谱之间往往存在显着差异。一个很好的例子是芳香氨基酸衍生物酪氨酸和苯丙氨酸,其复杂的双光子截面显示单光子激发有很大的不同。与此相反,色氨酸(图2)的双光子光谱非常相似,显示单光子激发的档案。

multi figure7

定量三维重建的和去卷积实验,光谱的荧光基团的双光子吸收进行测量,以确保激发波长附近的吸收带中的峰为中心。尽管双光子的横截面可以计算出,这个过程是复杂的最好的。直接的实验测量的吸收光谱是优选的方法,但是这些实验是困难的,因为少量的入射功率与在光源的强度波动吸收。热透镜效应,声光技术已被用来确定吸收截面,但也许是一个简单的方法,是研究光子发射与已知的量子产率的荧光团。当设计新的双光子实验时,应检查的范围内的荧光基团的二分之一的值,预期的激发波长附近具有吸收峰的。

 

7给出了测得的双光子荧光激发光谱特性的一些常见的荧光基团。图7中的数据代表的双光子的动作,这是来自通过服用该产品的荧光发射量子效率和双光子吸收截面的横截面。记录,可利用由锁模钛:蓝宝石激光器射出的直线偏振光的光谱。黑点表示在每个光谱中,荧光基团的单光子的最大吸收的波长的两倍。表1中是一个关键的两个字母的名称的代码,在图7中每个频谱旁。曲线代表的荧光基团的双光子激发光谱的横截面。

 

荧光小分子的双光子荧光激发谱

荧光名称
(缩写)

激发波长
纳米

(BM) p-bis (o-methylstyryl) benzene

691

(CB) Cascade Blue hydrazide trisodium salt

750

(YL) Lucifer Yellow CH ammonium salt

860

(BD - Bodipy) 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diazaindacene-2,6-disulfonic acid disodium salt

920

(DP - DAPI not DNA bound) 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride

700

(DN - Dansyl) 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine

700

(PY) 1,2-bis-(1-pyrenedecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine

700

(CM) coumarin 307

776

(IC) indo-1 with Ca++

700

(IF) indo-1 without Ca++

700

(FC) fura-2 with Ca++

700

(FF) fura-2 without Ca++

720

(CG) Calcium Green-1 with Ca++

725

(CO) Calcium Orange with Ca++

800

(CC) Calcium Crimson with Ca++

850

(F3) fluo-3 with Ca++

800

1

 

横截面的测量表明,双光子吸收的激发峰是非常类似的,相对于单光子的档案中(图7)或蓝移的趋势。可能是有利的耦合可用锁模激光器的波长范围内的荧光团激发的平均波长较短的。双光子吸收光谱的另一个方面一致的是,他们通常更广泛的比单光子。这简化了实验的约束通过增加适合激发的和增强的能力,同时激发两个荧光基团,有重叠的双光子的横截面,但广泛分离单光子光谱的波长范围内。三光子横截面的测量表明它们是在一般情况下,相应的单光子光谱非常相似。

 

虽然吸收光谱往往不同于单光子和双光子激发的荧光特性,以及其他如寿命,发射波长,和系间窜越速率似乎并没有受到影响。表示线性或非线性吸收达到相同的荧光激发态,并且一旦被激发的荧光基团,它的行为激励模式一样的,不管这样的相似性。这些租户还持有三光子激发,让研究者利用既定的比例和光谱方法在大多数的多光子实验。

 

照片和热损伤的多光子激发

所有形式的荧光显微镜遭受光损伤活细胞,其程度是依赖于激发波长,曝光长度,和用作蜂窝探针的荧光基团的化学性质。激发照明的损伤,可以划分为两大类:由于化学反应的热破坏和退化。光化学的副作用引起的生化反应,作为荧光团激发的结果,没有得到很好的理解,细胞和组织类型之间差异很大。另一方面,产生的热损伤,主要的两种机制,因为借着水和在在焦区的荧光基团的双光子吸收的单光子吸收发生。

 

在大多数研究的细胞(特别是哺乳动物细胞中),几乎不存在固有的荧光基团,利用多光子荧光吸收长波长的近红外激发辐射。然而,周围的细胞和组织中的细胞内和细胞间的水能够吸收红外和近红外照明的显着量的,产生多余的热量,有可能损害生物标本的可行性。另一方面,当含水的生物环境照明的可见光和紫外光的波长较短的共聚焦和宽视场荧光显微镜,显着量的热利用周围的水不被吸收。

 

的暖气由于单光子吸收,可水沿束路径的上方和下方的焦平面发生。控制平均的多条件下,已计算引起的温度上升,分别在7001000纳米,介于0.0651.1摄氏度。这些协议在1064纳米光镊激光激发的热量进行测量计算。激动人心的光束被固定的情况下,可能会发生更大的加热,随着时间的推移对数关系在迅速上升。暖气,由于荧光吸收高度本地化的多光子激发实验的震源区。随后的热释放内均匀发生一个球对称周边地区的焦点体积,并没有产生显着的热量,即使是在高浓度的荧光。

 

结论

多光子荧光显微镜是变给出一种方法,用于活细胞和组织的动态成像。该技术是特别有用的紫外线激发不会以其他方式是可能的,因为光学系统的光透射特性的生物系统。此外,在多光子激发的副作用,如漂白和光损伤最小化,并且只发生在立即周边地区的焦点体积。虽然预测和测量双光子吸收型材共同荧光正在慢慢地实现,这方面工作的一个显着量的留下来完成的。设计新的针对多光子激发荧光团仍然处于萌芽阶段,但应该沿着这条大道预计在未来几年取得了一些进展。

 

光毒性的细胞是一个知之甚少的现象,但不发生很大程度在大多数形式的荧光显微镜。较低的量子能量和较低的本征吸收较长的波长,利用多光子显微镜有助于减少光的有害影响活细胞和组织,细胞动力学开放的大门,新的调查。多光子显微镜研究中的一个主要障碍是设备成本高,尤其是必要的锁模脉冲激光双光子和三光子激发所需要的系统。超快激光系统普遍使用的两种主要类型是钛:蓝宝石和NdYLF激光器,这虽然是非常昂贵的,并不需要水冷却,也没有过多的电力需求。在Ti:蓝宝石脉冲激光(7001100纳米)的波长可调谐性,使其更为灵活比单波长的NdYLF激光器(1047纳米),但方便排除手动操作的总的可调谐性。随着新的,更便宜,用户友好的激光引入一个竞争激烈的市场,更多的商业的多光子显微镜系统将推出一个更便宜的价格。这种情况,再加上多光子荧光的实施,有没有物理限制的事实,将鼓励整个生物科学的广泛应用这项技术。