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徕卡显微镜:全内反射荧光显微镜(TIRF)

2013-10-16  发布者:admin 

全内反射荧光(TIRF)是一种特殊的技术,在20世纪80年代初在安阿伯市密歇根大学的丹尼尔·阿克塞尔罗德在荧光显微镜。全内反射荧光显微镜提供的图像具有出色的高轴向分辨率低于100纳米。这允许与膜相关的过程的观察。

3_CD44_1T

 

全内反射荧光显微镜

它允许靠近的玻璃/水(或玻璃/试样)接口的荧光分子成像。这是通过采用的渐逝波通过交付的弧光灯,发光二极管(LED)或激光的光激发的荧光基团,而不是直接照明。如果入射的光被全反射的两个具有不同折射率的透明介质的界面处发生的渐逝场。在生物应用中的入射光通常是激光和接口的玻璃盖玻片,盖玻片和贴壁细胞的膜之间的水溶液。

 

随着能量的渐逝场到界面的距离呈指数下降,只有在一定的接近盖玻片的荧光基团被激发。这允许创建的图像具有出色的信号噪声比,其余的细胞的荧光团几乎兴奋。此外,全内反射荧光显微镜提供的极高的轴向分辨率低于100纳米的图像。这使得观察膜相关的过程,如细胞粘附,激素结合,分子运输和胞吐(如神经递质的释放和吸收)和内吞过程。

TIRF-Grafik

图 1:TIRF显微镜的原理

 

全内反射和渐逝场

每当光遇到两个具有不同折射率的透明介质的接口,这将是部分衍射和部分地反射。的入射角一定的角度,即所谓的临界角,将被完全反射的光,这种现象被称为发生全内反射。如果光从更高的折射率(n)的(如玻璃皿中,n = 1.52),在培养基中具有较低的折射率(例如,水性介质中,n = 1.33)中的培养基中,才能观察到全内反射。的入射光,在发生全内反射的临界角(Θ Ç),可以由斯涅耳定律:

Snells-law

n1n2是试样的折射率和盖玻片。

在发生全内反射,一部分的入射光的能量将被转换成一个电磁场,并通过接口形成的界面处的渐逝波。新兴的倏逝波具有相同的频率为入射光和其振幅呈指数衰减的穿透深度。因此,内的倏逝波的激发的荧光团与光子的相互作用,但与电磁场的相互作用。在此字段中的穿透深度范围通常在60〜100纳米,但可以去到200nm。它依赖于光的入射角,波长和两种介质的折射率(例如玻璃盖玻片和试样)的角度。增加导致减少的穿透深度和较高的波长的入射光的光的入射的角度,导致增加的穿透深度。背后的接口的介质的折射率(例如,试样)的​​穿透深度的影响也有更高的折射率增加的倏逝波的穿透深度。还应当指出,在TIRF显微镜高功率的激光,这是比通常采用的激光共聚焦系统中,是用来形成有足够能量的倏逝波强。

 

物镜的全内反射荧光显微镜

在光学实现全内反射的方法有两种:一种是基于棱镜和其他基于物镜。基于棱镜的全内反射荧光显微镜,棱镜连接到盖玻片的表面,该表面定向聚焦光束或激光朝向的盖玻片/介质界面。随着棱镜的帮助下,穿透光的角度被调整到临界角。

 

现代全内反射荧光显微镜系统通常是基于物镜的。的光,通常激光的光被定向到的标本,也收集所发射的荧光通过物镜。它是强制性的全内反射荧光显微镜的物镜具有一个非常高的数值孔径(NA)(> 1.45 NA),它允许的入射角大于临界角的。物镜的数值孔径(NA)越高,未能穿透深度越低的渐逝场的光的入射的角度,可以更加平坦。的棱镜型方法相比,物镜的方法是更方便的使用试样以及访问,能够容易地改变激光光的入射的角度。通过放置在激光光斑的物镜的后焦面的不同区域中,用户可以选择的激光的入射的角度,并因此而改变的倏逝波的穿透深度。在基于棱镜的全内反射荧光显微镜系统的棱镜强烈限制了访问的试样,难以例如变介质,添加药物或进行生理测量。

 

此外,对应的激光,并使用不同的角度入射在棱镜系统要复杂得多。此外,激光TIRF系统基于棱镜中出现的安全问题克服物镜为基础的系统。棱镜为基础的系统中,同时激光更多或更少的公开引导到棱镜物镜为基础的系统中,激光被直接耦合到显微镜本身和退出的物镜在一个非常定义的方式。

 

全内反射在生物设置

正如上文所述,全内反射荧光显微镜的物镜具有高数值孔径(> 1.45 NA),这只能通过使用浸油或其他特殊的液浸介质实现。在典型的生物设置,用于生产的瞬逝波的激光的光,有通过的物镜,液浸介质中和要在盖玻片/水(例如,水林格的溶液,PBS或其他成像缓冲液)界面反射的盖玻片。为了避免反射和偏转的影响,浸没介质的折射率尽可能接近的盖玻片(通常为N = 1.52)。对于标准的浸泡油的折射率为n = 1.515 - 1.518在20°C 当然,浸没介质的折射率是温度依赖的。尽可能多的实验,特别是在活细胞成像,在37℃下进行,由温度引起的变化的折射率的液浸介质可能发生。要纠正这些变化,很多都配备了全内反射荧光显微镜物镜校正领。

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图 2:广角的的布雷斯特癌肿瘤细胞表达GFP标记的细胞粘附分子在细胞膜上表达的CD44的荧光图像。


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图 3:同样的细胞在TIRF成像。礼貌:玛丽亚·蒙托亚博士,CNIO,西班牙国家癌症中心,马德里,西班牙


在一个生物的设置中,会发生全反射的接口,在该接口通常是玻璃盖玻片之间,其中n = 1.52在盖玻片和细胞组(n = 1.33)之间的小的薄膜的水性介质中。渐逝场,然后通过该水溶液膜,直径为约7.5 nm和转移到细胞质的细胞下降为零,在一定的穿透深度取决于激光光的入射的角度的质膜。在一些景点细胞直接坚持盖玻片和盖玻片的细胞(例如,细胞粘着斑)之间没有水溶液中可以找到。在这种情况下,盖玻片和细胞之间的界面全内反射的地方。细胞有不同的折射率(约每组1.38)比水溶液,这些斑点,可能是不可见的,当系统设置的盖玻片/水溶液界面。根据斯涅耳定律,发生全反射的临界角取决于介质的折射率,因此的盖玻片/细胞界面的盖玻片/水溶液的接口不一样的。此问题是可以克服的,通过改变激光光的入射的角度。

 

渐逝场的性质,因为它是在呈指数下降,只在约60-100纳米的范围内(根据设定)的盖玻片/水溶液界面(或细胞本身)的荧光团被激发。这提供了一个轴向分辨率通常为60-100纳米(z平面),使观察,它们位于或关闭到质膜不被淹没由位于细胞的其余部分中的荧光基团发出的荧光的荧光基团。被激发的荧光团仅在一个“切片”的细胞渐逝场的事实,导致具有很好的信号 - 噪声比,几乎没有任何背景荧光外的聚焦平面制作图像。

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图 4:广角图像的微管蛋白表达CFP


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图 5:微管蛋白CFP TIRF图像。礼貌:德国马尔堡大学·雅各教授,的临床细胞生物学和细胞病理学系,马尔堡