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徕卡显微镜:荧光定量

2013-10-16  发布者:admin 

眼见为实-测量知道。这个方程反映在14 个世纪科学的发展,从自然哲学到现代科学同样适用于荧光成像和生物科学技术。显微镜生成图像不仅用于说明,但也量化。更先进的技术使用照明模式(无图像形成)或不会产生形象可言-但仍然是显微技术。这些F-技术正变得越来越重要,在当前生物科学。

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的扰动和松弛:FRAP和FPA

一个非常著名的化学和物理的方法是放松方法。测量的信号-在我们的例子中的荧光强度-平衡常数。-作为一个脉冲或跳的参数发生扰动后,强度将改变,并达到新的平衡。动力学的变化反映了该机制的细 ​​节,排除竞争的途径。该计划提供了一个优雅的方式来测量荧光标记分子的流动性。如果该字段的一小部分是通过施加强烈的光线(脉冲扰动)漂白,荧光将减少。情况下,分子是不能移动的,漂白面积将保持黑色。如果荧光分子通过扩散或通过活动进程,可以移动,将再次恢复荧光漂白区域。因此,这个协议被称为荧光漂白后恢复(FRAP)。拟合模型曲线的松弛部分的信号所揭示的基本机制。和分数的分子是不动的(不动的分数)是来自于均衡信号电平的比值。

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图 1:时间在FRAP实验过程中的荧光强度。在一个感兴趣的区域中,漂白后的荧光的强度恢复到一个新的平衡。恢复吨的1/2的一半时间,容易地提取从回收的动力学。另外,不动的部分漂白脉冲之前和之后的均衡强度的差异是明显的。

 

 

FRAP通常用于测量在细胞中的扩散过程。除了传统的FRAP,有时会使用衍生工具:瓣,这是荧光漂白后亏损。在这里,漂白连续发生在一个地区,有没有交集漂白面积。iFRAP表示整场除了一个小区域被漂白的方法。发现更多的缩略词漂白方法,但这些都没有实际意义。

技术上相似,但基于一个完全不同的机制,激活荧光蛋白实验。这些蛋白是荧光的,并可以由不同的照明颜色的接通和关断。或者,荧光发射光谱的变化后,开关照明。它的优点是,人们可以对一个黑色的或不同颜色的背景中检测到的荧光,并按照在细胞或组织(荧光蛋白激活FPA)的分子的扩散或主动转运。

这些方法并不只适用于流动性的测量,但也动力学测量浓度的变化。最为人熟知的,如钙离子指标。莫代尔生物传感器,往往基于FRET-FLIM的,允许各种各样的细胞以被监视的参数,其中包括代谢物的浓度和膜电位。

 

福斯特的相互作用:FRET

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图 2:如果发生福斯特共振能量转移的供体与受体的激发光谱,两个分子重叠的发光光谱非常接近(几埃)。时的距离一半的光子将被转移由该过程被称为福斯特半径(通常为0.2〜1纳米)。

 

 

当从荧光分子发射一个光子,波长为斯托克斯位移红色,即能量小于激发。如果第二个荧光分子(接受器)的第一个分子的排放物(捐赠者D)的范围内的激发能的紧密接触,能量被转移的概率增加的距离的6 个功率不发射和吸收(无辐射)。这种现象进行了分析,并首先正确描述西奥多·福斯特,因此被称为福斯特共振能量转移(FRET)。

一个直接的应用FRET的受体后,仅捐助照明(敏排放SE)所发出的荧光分析。另外,荧光共振能量转移效率由漂白的受体和供体荧光测量前,漂白后也被测量。如果发生FRET,捐助将更加明亮闪耀受体漂白后,没有能量流动的受体,因此所有的能量转化为供体发射(受体漂白AB)。进行这样的实验证明蛋白质相互作用,它们的相对距离。

FRET现象还利用现代生物传感器。这些是(往往是复杂的)分子,含有的供体和受体。结合后,或感测目标,该分子将经历构象变化,改变D与A部分的相对位置,并因此改变了荧光共振能量转移效率。这些传感器是非常敏感的,由于1 / r的6依赖福斯特的Wechselwirkung的。

 

 

荧光寿命(FLIM) - 告诉许多故事

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图 3:影响的FRET荧光寿命。如果福斯特半径内的供体,受体是不是没有能量转移,兴奋状态持续时间较长(无需额外漏)。当受体接近供体,能量转移到受体从激发态和激发态捐助只持续很短的时间。

 

分子或原子的电子系统,由一个适当的能源(颜色)的光子激发时,将假定激发态。从这个状态下,系统会放松下来到基态,散发出荧光光子。显然,系统必须萦绕在一段时间内处于兴奋状态。这段时间称为荧光寿命。在一个孤立的分子,平均寿命由量子物理学统治,因此物业的分子。统计分布的实际生存的平均寿命。典型的平均寿命跨度的范围为0.5〜10毫微秒。

在现实中,荧光分子与其他分子的微环境中与辐射相互作用。这些参数可以引起兴奋状态,放松更quickl。一个众所周知的现象是动态与其它分子相互作用的荧光淬灭。这里,作为热能量损失。第二个途径是的福斯特Wechselwirkung,如上所述。如果荧光分子(供体)与受体相互作用,平均荧光寿命降低,由于这一事实,即荧光共振能量转移过程是一个额外的竞争通路的荧光发射通路。荧光寿命的变化,因此表明FRET发生- FLIM的,这是实际测量的参数与生物传感器。最后,激动的状态可能与光子相互作用,从而导致进一步转换为其他状态,或通过发射一个额外的光子(刺激启动返回到基态发射)。

排放下降脉冲激发和随后的测量是通过测量实际的平均寿命的荧光染料,或通过的调制激发和测量的相位和振幅调制的发射。最准确的和通用的测量时间相关的单光子计数(TCSPC)采用从激发的第一光子发射的时间延迟的测量。其结果是一个分布曲线(通常是一个指数衰减),它允许提取的寿命曲线拟合。此方法被施加到所有像素的图像,最后产生的荧光寿命图像(也被称为“头图”)。在这些图像中的值是不是灰色的强度,但时代。

除了感测环境的优势,FLIM的独立的染料浓度和吸收的工件,例如在深层的样品。

无图像的显微镜:FCS和衍生工具

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图 4:在HeLa细胞中的TiF1a-GFP映射的浓度。APD的图像进行的校正与FCS点测量。投资回报为FCS测量显示为黑色十字架。的浓度,计算从自相关曲线(红色和蓝色的曲线图)。细胞内的浓度是一个空间的地图。相关曲线测量点产生颗粒蠕动信息。


共聚焦显微镜观察是从一个微小的衍射光斑发出的光。该测量是作为时间的函数的光的强度。通过扫描在样本点和斩波信号转换成短条,这些位可以被分配并存储在一帧存储区中的像素。如果正确触发,帧存储包含作为一个两维空间的功能(图像)的强度分布。

另一方面,它也有可能只分析信号及其变化-带或不当场移动样品。这种方法允许多种测量。首先,平均强度通常会减少由于漂白现象。此外,三重态动力学测量的不同层次之间的照明开关。最常见的,而不是平均的信号,但该信号的变化(波动)进行了分析。如果是所观察到的样品中的许多分子,有关的信号的波动是非常小的,因此无法估量的。这种微小的共聚焦的焦点只包含几个分子(取决于上的光学参数和染料浓度,当然)具有有益的功能。小分子的数量足以探测到由于扩散(或任何其他传输机制),焦点体积变化的发生是由于分子闪烁(分子承担暗的状态,并返回到兴奋状态)的数量和改建。

通过相关方法的变化的分析,允许测量的染料浓度(样品中的局部变化)和传输动力学。通过拟合模型系统来测量的相关功能,相关的分子运输机制的分类是可能的。定性的测量也是可能的 - 例如,在各个隔室的扩散系数。

已经开发了各种衍生方法的分离特定的相关性(FCCS)或改进的结果的可靠性和精确度(FLCS)。

 

电和光遗传学

除了上面提到的F-技术,很多其他的定量方法在现代研究。最突出的是,大脑的研究是一个领域的各种测量,使用显微镜和荧光。一个经典的测量电信号的荧光强度的变化(例如诱导的Ca 2 +浓度的变化检测出钙指示器)的相关性。的电信号通常,在大多数情况下通过膜片钳技术测量电极。

最先进的光遗传学的方法,即转基因修改应用光功能的蛋白质,是进入一个新的世界,需要测量的相关性。

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图 5:强度图(上图),电气数据(底部)在心肌细胞膜片钳实验记录。电流记录(紫色),触发脉冲(红色)和行触发(绿色)。荧光数据线数据采集的触发表明是完全同步的。礼貌:雷夫霍夫马德森,西班牙巴塞罗那,加泰罗尼亚心血管病研究所。