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尼康显微镜:电动显微镜的结构

2013-10-16  发布者:admin 

电动显微镜部件及配件启用研究者活细胞图像采集自动化,范围从毫秒到几十或数百分钟的时间刻度间隔时间推移实验是特别有用的。可以加装各种各样的售后辅助部件,如机电遮光器,电动物镜转盘,微处理器控制的滤波器切换(滤光轮),电动载物台,和轴向聚焦控制机制的研究级显微镜和交互控制由一个同伴工作站计算机使用市售图像采集软件包。然而,应该注意的是,组装一个完全自动化的和优化的多维光学成像系统是一个非常复杂的任务。

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各种商业系统可在非常高的成本,而这些往往是值得投资的多用户的核心设施。另外,成本可以降低至少50%的从头组装系统,但这一努力应仅限于实验室,具备足够的专业知识和经验,在光学显微镜。自动显微镜配置的首要问题是从不同渠道购买到良好的协调,高效的系统集成的硬件和软件组件。较新的系统从各大显微镜制造商正变得越来越更配备了更先进的高速快门,轴向聚焦控制系统,过滤器的更换器,照明源和强度控制,以及其它电动部件完全集成的高档与专有软件执行。

 

1中的广义活细胞成像配置利用一个倒置的组织培养显微镜。图中示出的所有的辅助构件维持培养所必需的,同时取得下的图像的明视场,相衬,微分干涉对比,和荧光照明。试样腔室在载物台上的位置,通常牢固地附着在圆形或矩形的载物台物镜开口,除简单的显微镜载玻片。培养室环境是一个有机玻璃外壳的,内置显微镜聚光系统,载物台物镜,和物镜转换器。由同一个控制单元,可监控机箱温度,而其他单位调节加热载物台物镜加热器的二氧化碳传感器和馈线罐阀。操作与一个单独的控制单元,其连接到主计算机(图中未示出)的激发和发射滤光片轮和CCD摄像系统。所有的设备被安装在一个面包板式隔振平台。

 

光闸

机电遮光器挡住光源照亮标本相机曝光(次),是特别重要的,当成像细腻荧光标本作为一种手段,最大限度地减少漂白和光毒性。这些设备是绝对必要的活细胞成像在很长一段时间,以确保并维持细胞活力。此外,遮光器可被用于选择多个光源和通路之间,例如,当传输和荧光模式之间迅速转乘收集两时间推移序列在每个时间点的图像。现代高性能快门的速度和机制快门功能允许用户管理的几种模式,由微处理器控制和操作能力。快速模式提供了最快的打开和关闭快门的动作顺序能够。稍微慢软模式逐步打开和关闭快门,以减少振动,并产生更安静的运行。不影响波长的光强度控制容纳由的中性密度快门模式,使有效孔径尺寸的精确控制,在快门打开状态,使它能够作为一个中性密度滤光片。许多快门控制器提供多种操作模式,可以连接一台工作站,来协调两个或两个以上光阀的动作。更强大的快门寿命评分数以百万计的周期。

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2给出了几个发现的快门设计,广泛使用在活细胞成像显微镜配置。的剖视图(图2b))示出了内部工作机制是描绘在图2a)中所示系统的基本快门。快门叶片挥舞铡刀时尚到位,以关闭光圈蘸通过保险杠和形弹簧丝组成的系统执行器和摇臂驱动臂组件。电子快门电枢通过接口连接器连接到外部控制单元可以单独或通过一台主机操作。靠近显微镜帧,不与其他部件干涉的情况下,使附着在上面的快门的基础上设计的截止边。图2c)中示出的滤光轮快门可以作为一个独立的开闭器或连接的电动化的(如下所述)进行精确的同时控制曝光时间和波长的滤光轮。

 

遮光器显微镜应用程序设计有光圈的直径从25毫米到35毫米不等。光圈越小模型操作速度更快,但往往限制了视场,并且能够产生渐晕的显微镜。较大光圈的遮光器是速度较慢,但减少或消除边缘照明效果。封装快门的外壳通常是机加工或浇铸在铝阳极氧化处理,然后处理,用黑色染料,作为一个散热片的致动器线圈。无封装许多遮光器可以增加安装的灵活性,但这种公开的刀片和其他内部组件从灰尘和杂物污染。为了尽量减少加热用热的电弧放电灯的活门装置,显微镜应用而设计的光阀应具有反射面对照明源的输入侧上的叶片。铍铜基板上的铝 的氟化镁合金沉积典型的高端的反射涂层,而更经济的快门叶片从抛光不锈钢制造。后者是不作为高反射率的,不散热,以及合金刀片,但在成本和更耐用的要低得多。

 

波长选择

自动多色荧光成像的最重要的组件之一是一种装置之间进行快速的切换不同波长的光,通过使用多个过滤器,分束单元,直接通过几个途径,单色器,或声光可调谐滤波器的光(AOTFs)。在标准配置中,安置在一个光学块的传统的荧光过滤器设置,并包含一个激励和阻挡(或发射)的过滤器,以及一个二色镜,引导到试样的激励光的发射光传送到检测器。活细胞成像,采用更先进的过滤技术,双色镜被保留下来,但是往往取代多色的衍生物,它包含多个带通区域。激发和发射滤光片从光学块中移除,并放置在下面描述的外部设备中的一个或多个。目前,有几个实际机制自动互换荧光过滤。最常见的涉及旋转的滤光轮是可靠的,价格相对低廉,并支持大量的售后市场和专有图像采集程序(实际上,驱动)。滤光轮的主要缺点是它们的开关速度的限制。售后滤光轮的主要优点是其高透光效率和灵活性,以市售的过滤器使用范围广。

 

滤光轮的设计保持圆形,扁平的光学干涉滤光片,中性密度滤光片,热过滤器,过滤器和紫外线过滤器中的轮,可容纳410之间的直径范围从25毫米至50毫米的过滤器(参见图3和图4)。轮安装在铝外壳,更换过滤器的过滤器插槽方便地访问,并且是由精确的步进电机的控制由一个外部单元(图4a)中示出)。该壳体包含一个光口(到每个过滤器可以连续旋转),用于连接到显微镜的照明源,通过使用专门的适配器,许多轮外壳还容纳螺栓上的快门组件。高端滤波器车轮都配有挂耳,使住房要牢固地固定在光学平台或振动隔离表。几个滤光轮设计有滑动或下拉外部滤波器持有人额外的过滤器(如中性密度),被放置在一系列干扰过滤器安装到车轮。滤光轮协调控制模块通过内部微处理器和功能作为独立单元或一些滤光轮的协调运作,遮光器,数码相机,和其它外围设备可以被耦合到一个工作站计算机。

 

一个标准的经济滤光轮可能需要多达100毫秒到一个新的过滤器旋转到位置,而更便宜和更快的车轮可以做的工作,在大约25毫秒。虽然这些速度可能相当迅速出现乍一看,开关时间尺度需要至少4秒记录两个波长的轴向系列20倍光学部分,因此,从严格限制的图像采集速度快速的细胞过程。此外,过滤器的轮子有可能创建机械振动,可以耦合到检测器系统通过显微镜帧和导致的图像质量劣化。直接连接到显微镜的主体时,滤光轮和光阀能够在操作过程中产生振动,可以持续数百毫秒。此神器可以严重降低图像的分辨率。

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振动问题也常见于商业研究级显微镜,其可以包含各种各样的电动元件。在有效地限制这些振动,制造商往往限制了连接的设备的速度(如轴向驱动器,物镜转盘聚光镜),或引入运动活动的停止和发作的图像采集之间的时间延迟。然而,在许多情况下,这些时间延迟降低了系统的整体性能,往往使不必要的光量的试样。制造商也在他们的产品库存增加,包括电动遮光器,滤光轮,荧光立方体炮塔,端口控制器,及相关配件,所有这一切都是通过一个单一的控制器协调。这些外围设备,能够快速从一个观察模式,自动切换到另一个,是理想的活细胞成像显微镜配置。其中提供了新的选择,是齐焦补偿,以配合不断变化的物镜,可调灵敏度微调对焦机制和电动功能之间的协调,以确保定时序列进行无间断的焦点。

 

旧显微镜,已经在该领域大部分是不能够利用新的自动外设由厂家提供的,而必须依靠售后设备。当安装这些设备,为谨慎起见,灯箱,滤光轮和快门组合件在一个单独的支架,外部的显微镜,安装,以消除振动,并允许组件之间的同步,而不需要引入的延迟时间。在大多数情况下,所附周边配件的复杂性需要组件之间的精确对准,并最好由将整个组件安装在振动隔离表或面包板装有减震器。这些平台的预钻孔和螺纹安装孔,以1英寸的间隔下。如图3中所示,建议设计,以减少振动工件的滤光轮与快门的配置。图中所描述的所有组件被牢固地安装在面包板或隔离表,并设有一个1毫米之间的空气间隙的滤光轮和显微镜和数字照相机系统,以减少振动耦合。在图图3a)中,所述照射器的准直器直接安装到容纳在过滤器上的车轮和铝合金支柱支持的快门。快门和变焦适配器之间的差距,防止快速快门的运动从扰乱显微镜。同样地,在图3b)中,有滤光轮和显微镜的帧,以及和相机之间的滤光轮之间的空气间隙。

 

另一个值得关注的排放口的旧显微镜附加滤光轮的潜在影响齐焦,创建带通波长变化,并促进畸变通过引入到聚焦光束从显微镜新兴的平面光板。根据显微镜的光学系统的配置后,插入到射出光束的发射过滤器可能会移位的焦平面上。该工件的严重程度来确定过滤器的厚度和折射率。此外,通过一个带通干涉滤光器以不同的角度聚焦的光通过可以引入的通带区域的中心波长的光束的不同部分的变化。这些问题很容易补偿售后适配器创建准直显微镜排放口(无穷大)的空间,从而使附着的滤光轮及其他光学元件的平行光路,所提供的适配器。

 

作为一种替代方法,滤光轮,一些多通道光谱成像系统的设计,使同时多色成像或光谱分离和线性分解,不改变过滤器的情况下,使用一个单一的数码相机的检测器。这些器件提供了优势,消除运动伪影,往往发生在连续成像的滤光轮,保持完美的图像之间的登记。多通道系统进行定量,多色实验(如共振能量转移),甚至单像素登记的文物可能导致重大错误时,是非常有用的。这些单元的缺点是:在过滤器的能力和减少的有效成像区域的传感器,它是减少二分之一或四分之一(根据内部的分束器配置和过滤能力)的限制。较新的多通道系统部分抵消了空间的限制,光分裂成两个独立的探测器(数码相机),每个配有独立的过滤途径和焦点微调,以确保像素登记。

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4中示出的波长转换装置的任一旋转入光路(图4a)段)的新的干涉滤光片或成独立的路径(图4b)和图4c))的发射光通过引导操作。一个典型的滤光轮配置在图4a),其中10个单独的过滤器单元被容纳在一个单一的框架。控制滤光轮由一个外部单元(未示出),并且可以迅速地在2540毫秒的时间刻度上的过滤器之间切换。在这些车轮的优势是瞬息万变的过滤器集和众多的配置可能性的激发和发射光的灵活性。图4b)中所示的双通道成像系统设有概述图4c)中的光学列车。在随后的讨论中,详细介绍了这些多通道成像系统,并且正迅速成为一个有用的替代滤光轮。

 

准直显微镜的光出射口,它通过一个单一的二色镜,入射光束分割成两个独立的光谱上不同的光束(见图4c)),并通过多通道成像系统的运行方式。一个光束中包含以下的波长的截止点的反射镜,而另一束包含以上的截止波长。的双束通过光学系统被折叠,并可以调整,相对于频谱内容,强度,和通过适当的过滤器来传递每个偏振。在过滤过程中,光束通过一个共同的摄像透镜,形成两个不同的检测器的面板上的图像在空间上和光谱。请注意,每个图像的位置,以便它被投影的检测器阵列的一半以上。单一的二色镜系统,光分割成四个通路,被替换为一个的三重带通版本,否则的功能基本相同的方式。

 

设计中的变化使输出的多信道系统中,2个摄像系统(如前面所讨论的)之间进行分割,使捕获的全视野的应用中,需要使用整个检测器阵列的两张图像。当结合的狭缝系统和自动翻译载物台,多通道系统可适应光谱成像调查。多通道成像系统的主要优点之一是消除图像采集延迟和潜在的振动问题,是由于过滤轮转动事件。因此,任何与捕获的图像相关联的延迟落在由检测器读出速度的限制。当耦合到电子倍增(EMCCD)相机能够在非常低的光线水平的快速读出,多通道成像系统能够捕捉到的亚细胞发生的事件,在更快的时间尺度比滤光轮配置。

 

活细胞共聚焦和多光子显微镜成像是有限的可用频谱线连接到仪器的激光系统。未来的波长选择在广角旋转磁盘和掠领域,以及宽带全内反射荧光(白光TIRF)显微系统最终可能转移,至少在很多高端应用,从通干扰滤波器可调单色,液晶可调谐滤波器的AOTF LCTFs)。单色仪光学显微镜相结合的电弧放电灯的衍射光栅的波长选择板和照明装置的聚光系统输出的光显微镜(通常是氙气)与(见图图8d))。快检流计驱动的输入狭缝和衍射光栅位置的控制时,这些设备,能够提供毫秒级精确的波长和带宽发生变化。液晶可调谐滤波器可应用于光谱成像,拥有高分辨率,大孔径,缺乏图像配准误差,以及合理的速度进行调查。在下行路上,LCTFs有限的光谱范围内,不同的带宽,低透光值(一般为30%的过滤器),以及需要增加光程。声光可调谐滤波器是一种新兴的波长选择在激光共聚焦显微镜的主力,但目前还没有看到其他成像模式的广泛应用。之前,必须克服这些设备使用广角荧光显微镜的活细胞成像应用成为常见的问题,如分散,带宽窄,分辨率低,图像拖影,和其他文物。

 

对焦和载物台控制

聚焦电机所连接的细焦点的传动齿轮组的显微镜,使自动化轴向聚焦控制通过图像采集软件。这些器件可以采用具有自动对焦功能的结合在软件或收集随后的解卷积分析和/或三维图像重建的光学部分的一叠。电动载物台可以利用与图像采集软件自动翻译阶段之间的两个或更多的视场或在多井培养皿中以及从一个到另一个。为了收集轴向的图像栈(简称作为Ž系列),显微镜物镜微调对焦机制必须加强通过试样的图像采集软件的控制下,在精确的时间间隔。各种电动聚焦装置,步进驱动器无论是整个消防水枪或显微镜载物台是从显微镜制造商和售后市场分销商。另外,压电元件可以连接到物镜转换器,把一个单一的物镜显微镜的光学轴沿向上和向下。步进电机的主要优势是其较低的成本和几乎无限的旅行距离,它提供了更多的控制权收集图像堆栈。另外,由于步进电机的设计工作通过显微镜传动齿轮,使物镜转换器中使用的所有物镜。步进电机的主要缺点是,它们是低于压电器件,并表现出显着更多的滞后。捕获Ž序列最快的模式是使用压电器件,它具有更大的精度和速度比步进电机。然而,压电驱动器具有有限的行驶距离(在100200微米之间)和更昂贵。

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5是一个高性能的电动拼装载物台,含有活细胞成像室。为消除横向载物台漂移的可能性和收集时间推移序列采集过程中的连续的图像中的两个或更多个视场这些载物台是非常有用的。售后市场电动载物台的设计无论是直流(DC)步进电机或伺服电机,其特征在于产生更高的翻译的速度(通常是双步进机),后者。能够精确地控制载物台上的位置(重复性)取决于编码器反馈系统,这也决定了决议的载物台运动。步进伺服电机的主要优势是其耐用性和出色的低速控制。一个典型的电动载物台的行程范围内,同时在y方向24英寸,和许多有编码器,可为40100纳米的分辨率和300750纳米的可重复性(返回到相同的字段的能力)。大多数售后电动载物台能够安装多孔板,瓶,培养皿,以及标准的显微镜玻片标本持有人,如全方位的。此外,许多载物台可以适应的环境控制活细胞成像实验载物台适配器。电动载物台,需要一个单独的控制器系统,通常配有一个操纵杆装置操纵横向运动。控制器既可以作为一个独立的设备或与其他配件的集成到一台主机通过RS-232串行端口或通用串行总线接口。

 

显微镜焦平面从活细胞中的连续的图像的收集过程中的轴向位置的波动的时间推移显微镜中最严重,最经常遇到的问题之一。通常被称为焦点的漂移,在显微镜焦平面的变化通常发生由于在成像室或房间内的温度变化中,该文书被容纳。各种市售的软件和硬件解决方案已经出台显微镜和厂家售后抗衡焦点漂移。的硬件设备是测量的物镜的前透镜之间的距离和反射的下表面接近的表面上的物镜(盖玻片)的试样通过检测光或声音的自动对焦系统。然而,这种方法可以被阻碍,用于高分辨率的油浸物镜时,由于对比度和反射率作为传感的光穿过油的损失。最先进的自动对焦系统使用低强度的近红外线激光或发光二极管(LED)源,以反映的照明光束,通过物镜和盖玻片的上表面上(支持细胞和培养基中沐浴),随后回收的物镜的反射光,并把它传递到检测器上,用于控制的反馈电路来调整位置的物镜有关的盖玻片培养介质接口。

的专有和售后显微镜自动对焦系统可以补偿所产生的温度波动的聚焦漂移(如上所述),重力,在浸没介质的粘度变化和振动。最先进的系统操作,通过不断比较在目前的轴向位置,在安装过程中收集的参考图像获取的图像。参考通常是从盖玻片,其强度很容易用一个专门的传感器电路的测量得到的反射图案。然后在显微镜轴向控制,以补偿热应力和机械漂移盖玻片重新定位在原来的焦平面中,从而提供清晰的对焦。操作员可以定义一个特定值(称为偏移量)为所需的轴向的焦点,这通常用含水的组织培养基或缓冲液的盖玻片界面的确切位置偏离。自动对焦系统可以纠正焦点漂移以毫秒为单位的时间表,基于软件的算法有明显的优势,这往往需要几秒钟(并能产生显着的光毒性和光)。

 

变量之间的自动对焦系统进行评估时,应该调查的是他们有能力处理复杂的成像多种功能在一个单一的标本在的几个轴向和横向位置。另一个重要特征是聚焦校正的频率和精度的补偿是否是连续的,或每个图像捕获之前立即应用。每种方法都有优点。利用实时观测实验,连续反馈系统的效率比那些正确的,独立的软件提示。然而,在拍摄图像时的首要考虑因素,使自动对焦紧接收购前是首选,因为严格要求同步图像采集与测量的参考点(每次重点进行评估,以确定是否发生漂移)。其中一个重要的时间间隔之间发生图像捕获时间推移实验,时间相对较短,需要测量焦点位置是无关紧要的。另一方面,在高速(230的每秒帧数)的在收集图像流时,自动对焦系统可能会产生一个工件被称为抖动,当他们试图纠正焦点无意中图像拍摄过程中的载物台翻译。

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在图6所示的自动对焦系统的主要优点是,在漫长的时间的推移实验中采集的图像序列。序列中的每帧的表示时间间隔为4小时。样品是灰狐肺成纤维细胞(线FoLu)细胞稳定转染的人β-肌动蛋白的与米樱桃荧光蛋白融合到细胞培养。集中在荧光标记的肌动蛋白细胞骨架应力纤维。请注意,图6中的单元格(a)至6(四)缓慢漂移的焦点,由于热波动超过16小时的时间推移序列。明亮和清晰界定的应力纤维(图6A))定义为重点开始漂移(图6b)条),直到唯一标记的肌动蛋白的褶边和胞浆池,可以可视化(图6c)和图6d))。相比之下,自动对焦,尖锐的肌动蛋白纤维(图6E))分散在视场中央细胞进入中期(图6f)条),但重新成为子细胞重新连接到盖玻片和蔓延(图6g)和6H))。维护期间重点延长时间的推移图像序列的聚集往往是成功或失败的实验基础。

 

评估自动对焦系统的最后考虑因素之一是所需要的时间的总长度,用于图像采集,其范围可以从数秒到数小时到数天。在较长的实验,不断反馈系统可能会阻碍了机械漂移由于滞后或蠕变产生的压电致动器中的文物。在短期内,这些问题通常无关紧要,但可以显着关注长期收购。这些问题都可以复合使用高数值孔径(倍率)窄震源深度要求严格控制的物镜。无论自动对焦系统的潜在文物介绍,他们目前的表现和持续发展的潜力已经被证明是最重要的资产之一高分辨率荧光显微镜的活细胞。

 

活细胞成像的照明光源

传统的照明系统采用了广角镜依靠钨卤素光源透射光的荧光激发短弧气灯。广角调查作为光源已经推出了激光配置数量相对有限,但在光学显微镜,共聚焦和多光子显微镜的广泛出现,大大增加了使用的激光器。因为信号 噪声可能是在活细胞成像中收集数据的一个最重要的变量,试样腔室必须具有非常高的光强度照射,以便最大限度地信号,并实现全分辨率的光学系统。然而,当通过100x物镜的数值孔径1.4集中在满功率,100瓦汞弧光放电灯将严重影响哺乳动物细胞的生存能力,在短短的几秒钟。产生类似的损害时,细胞在全亮度照明与钨卤素灯或氙气灯以较慢的速度,但高功率的激光器能够破坏细胞,甚至速度比汞灯时。其结果是,影响试样的光的强度必须被仔细的管理,考虑到强度和波长光谱。应该用在活细胞成像实验,只有有限部分的调查(实际上,荧光照明,光活化,光漂白等)是必要的频谱。在几乎所有情况下,光照水平和波长限制代表图像质量之间的妥协和维持细胞活力。

 

用于确定如果光照强度太高,最好的标准之一是观察细胞是否进入并完成有丝分裂的实验条件下。某些细胞,如胚胎,是比较耐可见光,可能是因为他们缺乏在DNA损伤反应途径逮捕分裂周期。然而,很多比较流行的哺乳动物细胞株,包括鼠袋鼠,猪腰,赤麂,以及最主要的文化,是对光线极其敏感。无论实验采用的光源,过滤器应安装在光学路径,甚至微量的紫外线和红外线辐射的照明光,以防止污染。

 

尽管现代的带通滤波器通常用于荧光成像在光谱的可见部分中的高的阻塞水平,他们仍然倾向于通过一些非常低和高的波长的辐射。因此,它是明智的,安装在光路中的廉价的玻璃过滤器,阻止上面的端部在可见光光谱的波长。这些额外的过滤器的应用是特别重要的,因为它们与汞弧灯的紫外线产生非常高的水平。卤钨灯发出的红外光的含量超标,需要红外滤光片的所有活细胞调查。与此相反,氙灯产生少得多的紫外光,尽管它们在近红外发射峰的日益流行的金属卤化物灯,而产生类似汞光谱线,在较长的波长具有较高水平的排放。

automatic microscope figure7

活细胞成像几种常见的照明光源的光谱剖面图7中。的水银和金属卤化物灯中存在的明显的峰在下面讨论。的钨卤灯有一个配置文件,在紫外光谱区中的输出产生相对小的,但在近红外波长的整平之前逐渐增加。灯丝灯泡的相对功率输出的是约25%的汞弧光放电灯,在可见光波长区域(550纳米)的中心。对比汞灯,氙弧放电灯具有与大部分能量集中在800纳米以上的波长在可见光区域的低功率输出。但是,氙气灯的输出的档案是连续的,在可见光波长比汞和金属卤化物灯。图7中所示的所有的光源成像活细胞中发现显着的实用程序。

 

对于对比度增强技术,在明视场模式下(主要是DICHMC,相位相反的)的成像单元中,最常用的光源是100瓦钨卤素灯。在长期的实验,这盏灯是特别稳定,输出波动(时间和空间)在正常工作条件下,只有轻微的程度。需要数百甚至数千张图片,在一段较长的时间推移实验,以确保增加的时间稳定性,稳压电源可以安装在系统上。通常情况下,这方面的努力是必要的实验室环境,线路的功率是受频繁电压下降。在明场成像模式中的总光强度降低时,绿色或红色的过滤器是用来阻止紫外线和蓝光的波长保存细胞活力的目的。在许多情况下,一个546纳米绿色的干涉被用于DIC和相衬,但更长的波长滤光器通常会工作,以及。请注意,一个绿色的干涉滤光器,在明场成像模式中校正色差的经典使用现代先进萤石和复消色差的物镜不再是必要的。

 

概括地说,照明源的波长范围内是最无害的试样应采用明场成像。广泛的调查发现,大部分细胞有宽容一点紫外光和红外光,是最敏感,其次是绿色和蓝色至红色波长。因此,从生物学的角度来看,它是合理使用红色光(600650纳米)为活细胞的调查,只要有可能,即使波长较长迫使分辨率和妥协一些CCD相机在这个区域不敏感。的分辨率的问题比细胞生存力是不太重要的,通常限制在更大程度上由细胞内部运动,温度漂移和缺陷的光学和照明系统。相机感光度的限制正在迅速的制造商,他们都在努力设计更均匀地在整个可见光谱响应解决。

 

短弧等离子灯的最高亮度和光彩输出任何连续运行的光源和方法,非常密切的,一个点光源的理想模型。然而,强度比灯丝(钨-卤)灯,电弧放电灯具有显着较大的波动,因为气体等离子体本质上是不稳定的和受影响的受磁场电极的侵蚀。短期稳定性主要是由三个工件的钨电极之间产生的电弧的影响。电弧漂移发生时的圆弧的连接点上的圆锥形阴极前端面穿过的圆形图案的电极中,通常会需要几秒钟移动一个完整的圆。 喇叭指的亮度变化的瞬间,当电弧重定位到新的在阴极上具有更高的电子发射质量比以前的附着点的区域。对流电流之间的电弧的温度差和包络产生电弧表现为快速弧柱的横向位移,这是由于在氙气或汞蒸气。除汞,金属卤化物电弧放电灯含有卤素,如碘,溴,和操作中的一个过程被称为/卤素循环的卤素防止蒸发的钨,由电极发射的墙壁上沉积的包络,从而延长了灯泡的使用寿命和稳定性。目前,这些光源是在荧光显微镜中产生的最优选的照明光源。

automatic microscope figure8

从一个标准的汞灯(HBO 100瓦)的辐射输出,只有45%是有用的荧光显微镜波长350700纳米之间。此外,大部分能量集中在突出的谱线在366纳米(10.7%),436纳米(12.6%),546毫微米(7.1%),和579纳米(7.9%)。有用的输出功率从XBO氙灯(75瓦),虽然在350700纳米范围内相对统一的,构成大部分能量(约74%),居住总只有24.5%的近红外波长较长。氙弧放电灯往往是采用广泛的激发波长时是必需的。氙灯的光谱输出的模拟太阳光,因为它提供了特征的激烈的宽带没有突出的线无论是在紫外光或可见光的波长区域的照明。

 

8中的一些最先进的照明光源,目前可用于活细胞成像。的金属卤化物灯(图8a))正迅速成为最通用的宽视场显微镜来源之一,经常被销售作为汞弧光放电灯的替代品。外部的氙气灯室(图8b)和图8c))通常是耦合到一个准直透镜,安装在显微镜上的输入端口通过单模光纤或者液体光导。最通用的光源是单色(图8D)),可以选择特定波长的激发,但也是最昂贵的选择。通常采用氙弧灯相似,的单色可以取代灯箱和激发滤光片轮,使极快的波长调谐在荧光显微镜。总之,照明选项,如图8所示显微镜具有广泛的选择,可以适合大多数预算。

 

已花费了相当大的努力合成荧光团有最大吸收峰位于突出的汞谱线附近。例如,经典的探针罗丹明Mitotracker有红的吸收在546579的汞线,分别以高效率的Alexa Fluor系列染料,而具有极大值对应的大部分汞峰(350405440546,和568)。了很多年,汞弧光放电灯是最普遍的荧光显微镜中的光源,但如上面所讨论的,它们不提供均匀的照明领域,并在短的时间内表现出较大的波动在输出。这些工件都可以呈现显着的问题,在定量分析的荧光。金属卤化物灯中含有类似HBO汞灯的光谱线,但也表现出非高峰强度约50%,更强大的。因此,并不强烈兴奋峰汞灯发射光谱,如荧光的Alexa Fluor 488荧光团,与金属卤化物照明光源,产生明亮的图像。此外,金属卤化物灯,汞灯,质量,很容易检测到与数码相机相比产生更均匀的辐照度。氙气灯,虽然不亮,也更稳定,比汞灯和提供几乎恒定励磁照明在整个可见光谱的荧光基团。为了克服与电弧放电灯的非均匀照明的问题,液体光导(下面讨论)可以被利用耦合灯箱显微镜输入端口。通过散射的光通过导光产生一个更均匀的领域。输出的时间波动是更难以控制,但已经与最成功的反馈机制,控制输入功率的灯。

 

传输和荧光显微镜活细胞成像通常配置科勒照明下进行操作。这种普遍的照明方案,用于均匀地照明的图象场的空间复杂的来源(电弧放电或卤钨灯)只在传输模式中的聚光镜或物镜的后焦平面的焦平面的源程序的一部分,由成像落射荧光模式。引人注目的标本甚至是源光,虽然这光从所有可能的方位与公平分配可能无法到达。该字段的光圈(有效的是在中间像平面)成像到样品上,以限制在不影响照亮区域的照明光的角度。在高度非均匀的情况下,扩散过滤器也可以使用位于焦平面上的均匀性进一步提高。科勒照明是不是最有效的系统,因为它不使用的完整的源极或发射的光的角分布,表面。然而,在显微镜配备只有一个灯箱,饲料直接送入聚光镜系统的照明,科勒照明显微镜对准仍然是最佳选择。

 

虽然科勒照明系统的功能,以确保均匀的照明,并控制它的连贯性,但也可以使用光导,以实现均匀的照明。争先恐后的光,有效地降低其空间和时间的连贯性,也通过光导应用。一个光源耦合到显微镜的同时也降低的连贯性,使用最广泛的和实用的方法,是将光聚焦成一个灵活的长度的单模光纤或者液体光导(参见图9)。热运动中的液体光导不断改变光路和光的散射,使空间和时间的连贯性,有效地消除。在盘绕单模光纤的情况下,包层的反射不断地改变,因为光纤稍微弯曲,产生一个射出光束,实际上是均匀的强度在时间和空间。在加扰的光纤维(在高达100千赫兹的频率)的振动的技术也是有效的。轻相炒,由于路径长度不同的光波通过光纤辐射和高单色性,虽然被保留。射出光束是由顶帽的强度分布而不是高斯分布的激光的有特征的描述。为了避免可能的热损伤的光的加扰器,红外辐射以及其他不需要的发射波长应被删除,才能进入光纤或光导。在理想的情况下,只有图像形成的关键的波长应该留下的光源(光纤和液体光导传输的档案都在图9中)。,而不是依赖于宽带镜,冷镜和带通干涉滤光片应选择光圈磁盘传输的光的波长,并允许不必要的热量逃脱。

automatic microscope figure9

使用液体光导的一个关键问题,或在显微镜的光纤的外部光源灯输出到光纤的耦合效率。大多数光纤的数值孔径在0.20.55之间,并且该值应相匹配的源收集的光学。一些制造商提供设计实施在满足此条件的液体光导灯室。在旋转盘共聚焦显微镜,扫描机制采用的照明方法,填补了后孔的物镜。可用的来自光源的光耦合到试样是一些涉及在非激光的情况下,因为信息源,例如弧光灯辐射到一个球体,而不是产生平行光束。因此,反射镜所需的直接光从背面向试样的圆弧。的不需要的波长,例如红外线和紫外线,可以被允许通过一个红外线发射器被表示为冷反射镜和紫外线发射器的热镜)的二色性反射镜(和灯壳体中的被吸收。通过冷反射镜的热耗散减少源的机械和光学部件的热膨胀引起的运动。在各种形式的显微镜,镜头靠近热源来源必须安装适当的允许热膨胀。各种售后光源夫妇显微镜外部光源(通常是氙气金属卤化物)通过光纤或液体光导(见图8)。此外,专门单色器提供精确的波长选择。虽然价格不菲,这些器件提供了一个很好的替代定量显微镜。应接近最终行使选择合适的照明光源和波长区域为活细胞成像的理解是,高强度的光,任何颜色本质上是有害的活细胞。无论是否进行了优化的波长范围内,光源必须在任何时候都关闭了,除了当图像被收购。

 

活细胞成像软件

设计用于光学显微镜的数码相机一般都连接到主机计算机工作站,它允许用户调整相机设置,预览标本,收集图像,并存储在调查过程中收集的数据。在流行的摄像头接口总线是火线(IEEE-1394),通用串行总线(USB),传统的串行端口(RS-422),小型计算机系统接口(SCSI),所支持的广泛的专有接口摄像机专用集成电路板插入到计算机中。活细胞图像采集专用的计算机将需要快速的微处理器和一个显着的随机存取记忆体量,以及足够的硬盘空间来存储图像和数据。该建议的出发点是3千兆赫(千兆赫)处理器和至少1千兆字节(GB)的内存。硬盘驱动器的价格相对便宜,所以工作站应该有一个或多个250 GB驱动器和一个高性能的图形卡将显着受益。用于将数据写入光盘(CD)或数字通用光盘(DVD)的磁盘驱动器还建议。显示器应该是一个高分辨率的平板,节省桌面空间,并提供明亮,锐利,图像无闪烁。

 

与大多数数码相机系统提供的图像采集软件,是用来调整相机设置,如增益,偏移,曝光时间,和分级。一些更复杂的产品的也能够执行图像处理任务的不同程度,包括亮度,对比度和灰度的控制,添加伪彩色,图像合并,创建叠加层,并产生数字视频序列。收购后的图像分析,反褶积,和复杂的测量,以及额外的硬件(如滤光轮,遮光器z轴驱动器,载物台等)必要的总量控制,最先进的软件套件将提供广泛的工具自动活细胞成像。驱动程序可从两个摄像头和软件制造商,几乎每一个型号的数码相机的图像采集和显微镜控制软件程序接口。此外,许多相机厂商也为专门的功能集成到摄像头的驱动软件编程感兴趣的研究人员提供软件开发工具包。现代激光共聚焦显微镜都配有软件比使研究者能够立即分析结果,从实验,包括共定位,光漂白,共振能量转移,光活化,以及各种其他技术。定制的活细胞成像配置选择软件时,研究者应该考虑一个包,允许最大的灵活性,设计实验。

 

结论

活细胞成像的光学显微镜系统在配置载物台,要记住的最重要的考虑,是一种妥协,必须经常保持细胞可行,实现了最佳的时间和空间分辨率之间。最商业化的显微镜的设计,以达到尽可能高的图像质量,但不一定配置保持健康的细胞培养。然而,仔细规划,标准的现成显微镜可以很容易地改装成一个真正的活细胞成像系统。基本考虑是标本室,焦点漂移,数码相机系统,照明光源,遮光器,过滤组合,振动补偿,和软件接口整个系统成为一个有凝聚力的单位。虽然有许多替代品在前面的章节中讨论的系统,在众多的调查,在这次审查中所描述的概念已被证明其效用。