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徕卡显微镜:相衬-使未染色相对象可见

2013-10-16  发布者:admin 

相衬是使未染色的相位对象(例如,扁平细胞)在光学显微镜下可见的光学对比度的技术。出现在明不起眼的和透明的细胞可以被视为在高对比度和丰富的细节相衬显微镜。

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使用图像形成的相移

相对象引起的相移的标本的光通过。因为只有振幅位移(强度差异)对于人眼或光电检测器是可见的,染色的标本介导的振幅移位和通过的光的强度的差异。许多染色试剂的活细胞是有毒的,但是。相衬显微镜提供了一个可以使用的光程长度的差异所造成的相移的标本在光学显微镜下可见。它通过干扰导致光波的振幅变化的相移变化。

1930年由荷兰物理学家弗里茨泽尼克相衬显微镜技术开发。泽尼克技术在1942年投入使用后,于1953年被授予诺贝尔物理学奖。

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图 1AMDCK细胞,相衬显微镜


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图 1BMDCK细胞,明亮的视野显微镜

 

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图 1C:阿米巴变形虫,相衬显微镜


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图 1D:阿米巴变形虫,明亮的视野显微镜

 

光波的干扰

的光路长度的光路中的两个点之间的折射率和厚度的商品。这是相关的渡越时间和光速。中的差异导致的光的波以不同的速度的光路长度时,通过试样(即相移)。其结果的相位差发生。较高的折射率比周围介质的光波,其相位的相位差导致的减速。

干扰介绍了两波与对方的互动,形成一个新的波浪图案叠加原理。相关参数的干扰光波,光波的振幅。如果两个波干扰,产生的光波的振幅等于两个干扰波的振幅的矢量和。

如果所产生的波的振幅增加时,建设性的干扰将被描述为。这将是要么两个波峰或两个波谷的情况下,如果在同一个时间点见面。一个波的波峰和波谷又一拨也有可能是在同一个时间点见面。这将导致降低所产生的波的振幅。然后,这两个波之间的干扰被称为破坏性的。

用相衬显微镜的光路中

相衬显微镜的关键要素是环光圈和相位板。环空孔被放置在冷凝器的前焦平面限制贯通光波的角度。的相位板位于物镜的后焦面和具有相位环的材料制成的,通过它的光变暗,并且改变其相位通过λ/ 4λ为光的波长。

在相差显微镜科勒照明的条件下,这是不与试样相互作用的光波集中在物镜的后焦面,为亮环。空间的光环环沿着光轴相匹配,并导致不偏离的光的相移。光的衍射的试样不主要取得的相位环,因此,不会受到影响。

受影响和不受影响的光波之间的是一个总的为λ/ 2的相移。不偏离的光的相位是先进的λ/ 4的相位环,衍射光的波通常是λ/ 4的延迟的生物样本。λ/ 2的总的相移可以在图像平面上的光的波的破坏性干扰。暗淡的不偏离的光通过相位环,重要的是要避免的不偏离的偏离光相比一枝独秀。

λ/ 2的相移,在相衬显微镜观察,波峰和波谷有效地满足在同一时间点上产生了一个极大的破坏性干扰效应。因此光的波的振幅减小,被变换成幅移相对象的相移。

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图 2:在相衬显微镜的光学路径。的环形形状的光聚焦在试样上通过冷凝器,通过冷凝器的环形带。部的环状的光衍射结构的试样(例如质膜,细胞器等),光密经历了相移约¼λ(通常为生物试样)。此相移,并绕过衍射光的相位环,和由相位环(大多分布在物镜的后焦平面)几乎没有影响。与此相反,直接来自冷凝器的环形带的环形光击中的相位环,这将暗淡的直射光引起的相移(通常是先进的¼λ或滞后¾λ为正相衬)。作为折射的光之间的总相移的标本的光通过相位环½λ,破坏性的干扰就会发生。光密的结构也将随之出现深(正相衬)。

 


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图 3:相环相衬显微镜的核心组成部分。一般它是由一个灰色的过滤器和一个保持板。没有出现衍射,通过试样的一部分光通过相位环(左箭头)。灰色的滤光变暗以避免光照射。保持板的非衍射的光的相位延迟允许干扰的光波,经验丰富的相移和衍射,通过检体(右箭头)。

 

正面和负面的 两种形式的相衬

有两种形式相衬:正面和负面的相衬。它们的主要区别在于由相位差板的照明使用。正相衬,光通过相位环的相位前进相比,偏离光,而被延迟的相位在负相衬。在负相衬的相位的相位差导致到破坏的相位差。光波相和的,建设性的而不是破坏性的干扰发生干扰。这将导致产生的光的波的振幅的增加。  

正相衬显微镜,具有较高的折射率比周围介质中的对象比折射率低的对象的显示的颜色较深。对于负相衬相反。

解读相衬图像

相衬显微镜可视化的标本的光路长度的差异。的光路长度与试样的厚度和折射率。蜂窝结构,如细胞膜和细胞器的光学路径长度产生深远的影响。由于许多细胞(尤其是在细胞培养)有平面和定期的形状,它们是很难在明显微镜可见。

甲这种细胞相衬图像放大细胞结构的差异,可以看作是光密度图,作为光密度值的标本或材料的折射率有很大的影响。然而,一些效果复杂的相衬图像的正确解释,因为他们不直接依赖于不同的光程长度。

光环效应描述的外观,明亮的边缘正相衬或负相衬大型物体周围黑暗的边缘。晕圈的形成,因为从检体穿过的相位环,以及衍射光。在不偏离的波所形成的光的环比的相位环和低空间频率衍射光波从检体,可以通过该环形带的小一点点。偏离的光通过相位环保持90°的相位差,因此不会受到破坏性干扰。这导致了逆转相反的边界处的大对象导致的晕。

关闭遮阳效果描述与周围介质相同的光照强度均匀的部位的标本显示的情况下。虽然这些区域的光通过经历的相移时,只有轻微的衍射和散射角大大降低。因此,这些光波进入相环,如不偏离的光线并没有受到干扰。

相衬显微镜中的另一个问题是对比度反转。如果存在具有非常高的折射率与低折射率的对象的对象,它们会显得更亮,而不是更暗(正相位对比)。在这样的区域中的相移是不是通常的λ/ 4移位的生物样本,而不是相消干涉,发生相长干涉(相反为负相衬)。

虽然这些效果可以使相衬图像难以解释,相衬显微镜是一种方便和重要的光学对比度成像技术相对象。此外,相衬显微镜使细胞功能和结构的调查活标本,成为最常生物学研究中的应用对比法

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图 4A:黑,相衬显微镜


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图 4B:大鼠睾丸,相衬显微镜


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图 4C:菜豆,相衬显微镜