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尼康显微镜:水浸物镜的结构

2013-10-16  发布者:admin 

薄切固定的组织切片和活细胞附着到玻璃基板上的微观调查,定期制作精湛的高清晰度图像时,用人的计划复消色差透镜或萤石物镜的具有高数值孔径。然而,目前的生物研究的显着量的涉及到生物体组织内,其中重要的事件可能会发生内的检体的深部,远离玻璃盖的细胞动力学调查。尝试细胞的细节图像,并与传统的油浸技术从标本玻璃盖千分尺距离活动经常遭受的文物,包括严重的光学像差(球形)。作为液浸介质中,使用水代替油,是一种有效的方法来克服的像差问题,涉及活细胞和组织的应用,高度校正后的水浸物镜已经由几家制造商引入。

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最近的技术进步,加上新的荧光探针的发展,仪器仪表和软件系统相结合,显着推进在活细胞和组织研究的前沿知识。的主要光学和定量的成像技术,利用这些调查包括共聚焦和多光子显微镜,微分干涉相差(DIC),和传统的宽视场落射荧光方法。在活细胞研究的一个基本问题是需要的细胞被包围在一个适当的营养生理溶液的腔室或容器,以及区域或感兴趣的事件通常位于50200微米以上,远离玻璃盖,妥善保养。一些研究者已经讨论了采用高数值孔径的油浸物镜成像焦平面,还不能立即相邻的玻璃盖的局限性。确定的最严重的缺陷是降低分辨率和图像强度,并,这些工件成为显着的距离超过约15微米的玻璃盖。折射率的光路中的不匹配所造成的球面像差的图像质量恶化的首要原因,这个像差的增加成正比的成像深度。

 

利用浸没流体的主要理性实现的物镜的最大数值孔径,提供改进的衍射限制的空间分辨率。然而,比较实用的优点是,不太可能发生的球面像差。由于典型的显微镜物镜的光学玻璃的折射率,最高目前由油浸物镜最终光学性能。在理想的成像条件下,最佳的光学性能是通过使用浸油物镜前透镜元件和玻璃盖的折射率完全匹配。换人水或其它液浸介质具有较高或较低的折射率,这会降低性能。然而,在情况下,是不理想的,其中球面像差成为图像质量的限制因素,较低折射率的浸没液体的使用常常是有利的。介绍含水介质中的成油状物浸没系统的光路的增加的球面像差,以及实现采用水浸物镜的结果,简单地从当时的成像条件下的最重要的和限制的像差减少的好处。

 

光思考理论

在活细胞和组织的研究应用最广泛的方法之一,是传统的宽视场荧光显微镜,在高数值孔径的油浸物镜紧邻玻璃盖的相对平坦的试样用于观察。固定的组织切片或细胞被嵌入在水性介质中具有不同的(低级)的折射率比玻璃盖。折射后出射的光的客观穿过浸油和盖玻璃(由设计具有相同的折射率),并遇到接口与包埋剂,具有不同的折射率。上面的折射率界面的光偏差的净效应取决于观察面的深度。在焦平面附近的玻璃盖,在物镜光学设计要求被满足时,系统的性能相当不错。

如共聚焦和多光子显微镜技术的引进和开发,改变了成像的要求从传统的情况下,通过使研究更厚的标本,大标本量的三维可视化,往往涉及某种形式的图像卷积或重建。的图像的光学部分在远离玻璃盖接触,试样,大深度的能力,在该系统的光学特性的改变的光穿过的培养基中这是不希望的设计。光学矫正是优化的光分布在均匀介质中相邻的玻璃盖,尽管在实践中,观察量可能相差一定距离,和由折射率差的焦点的距离的光的分布显着影响从玻璃平面。所产生的偏差造成损失的分辨率和信号强度,以及重点转移。指出在20世纪80年代中期,在分辨率和图像亮度降低,发生在许多情况下,当飞机从观察到更深的区域在试样试样玻璃界面,由Stefan W.地狱和其他,并成为主题大量的研究,旨在在共聚焦荧光图像的解释。

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如图2中所示的油浸物镜功能的理想情况下(图2a)),比较光的情况下的折射率之间的不匹配的浸油和水性介质严重的图像畸变的结果(图2))。成像由含水介质中的区域是分开的玻璃盖的试样平面代表为准厚的生物试样研究的光学条件,所遇到的图像劣化是一个主要的水浸物镜的就业激励。

 

复消色差透镜的俯视油浸物镜的就业情况建立了理想的光学当试样是在直接接触玻璃盖,以确保均匀的折射率(名义上为1.515),在试样表面的整个光路从焦点通过盖玻璃,进入浸油,并继续到前面的物镜元素。在此配置中(图图2a)),无折射光波发生的物镜的数值孔径,是利用。此外,镜头畸变控制,所产生的图像表现出最大的分辨率和对比度。

 

由于焦平面调整向更深的区域内的细胞或组织的部分,或者如果位于下方的层的生理介质中,光路穿过折射率接口或梯度之间的试样组(n = 1.35),生理食盐水溶液试样溶液组(n = 1.33),和盖玻璃浸油物镜的组合组(n = 1.515)。于各折射率界面,其结果发生的折射光线的物镜的数值孔径,没有意识到,作为物镜偏离其设计准则,介绍了光学像差。向着光轴折射引起的光线弯曲,因为他们通过从含水介质中的折射率高的玻璃,有效地限制了的物镜的最大数值孔径(参见图2b)条)。水引入的光路中的浸油系统,利用一个1.4数值孔径的物镜,例如,降低的有效数值孔径为1.33到最大值。通过一层水或生理介质中观察试样时,油浸物镜不能满足其设计性能,并导致严重的不利影响,在图像中引入的球面像差。这些效果在试样的深度成比例增加的焦点的距离变得更远的玻璃盖的下表面上。

 

在涉及的摄像的活细胞,利用浸油的研究中,球面像差变成图像质量的一个限制因素。按比例增加的细胞物质或周围的细胞的含水介质中的像差成像深度表现为减弱的强度和对比度,防止较小的试件的详细信息的分辨率。实验已经表明,这种失真的影响足以引起误解的检体的结构,如海洋生物中的纤毛。反褶积方法中的应用数学补偿的失真的这种性质是一个可能的解决方案,虽然精确的测量的点扩散函数(PSF)是必要的,并且实现这一点成为问题的点扩展函数时,被扭曲的轴向和横向。

 

在所有三维显微镜,它被越来越多地应用于活细胞和其他非嵌入的生物标本,在点扩散函数的像差的调查方法,是显着的,因为相对低折射率的标本。点扩散函数的扭曲诱导的球面像差,在共聚焦显微镜中的特别重要的意义,因为可以有损害的能力,共聚焦显微镜的主要优点:消除外的焦点信息,以提高对比度和有效的xy平面中的分辨率,以及创建高分辨率XYZ光学部分。折射率不匹配的图像畸变的原因是在一定程度上,水浸的就业物镜应该大大增强高分辨率深度依赖低折射率成像的标本。

water immersion figure3

在一个三维的试样的显微镜,图像数据可被认为包含畸变的试样的表示形式,或已经模糊了,由三维点扩散函数。如果反褶积方法将被利用来重建对象的异常的图像数据,点扩散函数的精确量是必需的。无论是直接测量和计算方法来描述点扩散函数,每种技术都有优点和缺点。当实验对比油状物浸没系统和水浸获得的数据,通过测量或计算的三维点扩散函数,焦平面依赖球面像差显着地降低在水中浸没系统。

 

和浸入物镜试样(油和水)之间发生的成像光线追迹的比较在图3中,随着几何模型的荧光珠在含水介质中的接口100微米以下的xz图像的预测。在图3a)图中,在左边的球体表示的荧光珠的实际形状,而在右侧的细长形状是提供的油浸物镜成像的印象。光线追迹到油浸物镜前面的镜头(图3b))和水浸的目的(图3c))珠(图3中的黄色箭头)的折射率不匹配如何掩盖实际试样透露细节的几何形状。在水介质中,在胎圈到一个明显的细长椭圆形失真油浸物镜成像时,如在图3b)中示出,但仍使用水浸物镜(图3c))时,球形。一个蓝色的球体表示的实际试样的表观图像被表示为一个红色的椭圆形或红球。

 

在用于三维图像数据的顺序是一个可靠的真实样品的代表性的点扩展函数卷积,它必须是已知的,不随轴向或横向的焦点位移的点扩展函数。在实践中,这可能不是设计的物镜是,如果条件没有得到满足的情况下。的物镜的设计标准试样中,浸没介质,和玻璃盖的厚度和折射率的折射率的函数。当试样液浸介质匹配的折射率,像差被最小化的任何试样的厚度,因为聚焦在试样中的更深的平面介质结合在该介质中的光路长度增加补偿减少的​​液浸介质中的路径长度。两个阶段位移的影响可互相抵消,从而使透镜系统的目的和图像共轭的表面重合,如所需的图像形成无像差。油浸物镜,因此,利用图像包埋标本,但表现出显着的点扩散函数的图像低指数生物标本时沿光轴偏差达到了设计要求。在一个系统中,其中沿轴向变化的点扩展函数,点扩散函数将计算为每个图像平面中的三维堆叠,需要一个复杂的模型,用于计算的方差,以及一个图像处理算法的强大的比卷积。这些因素提供了强有力的理由调查三维生物标本,利用水浸物镜在努力,以尽量减少轴向点扩散函数的方差,以及由此产生的图像畸变。

 

水浸入式光学设计和性能

任何浸泡的目的,需要前镜头元件和试样之间的空气以外的流体的基本功能之一是为了增加系统的数值孔径。在利用油浸物镜,它最初出现。将玻璃盖的厚度并不重要,因为它的折射率大致匹配的浸没流体。这实质上是真实的,只要试样安装在加拿大香脂或其他类似的折射率的介质的玻璃盖。当试样安装在水性介质中,如生理盐水中,具有显着不同的玻璃和浸油的折射率,光学性能的变化相当大。因此,聚焦通过什至10微米厚的水层可以引入严重的图像畸变,由于非对称,相对于焦平面的点扩展函数(参见图2和图3)。样本,除非在观察区域中直接接触玻璃盖,利用修正油浸物镜的透镜像差的光学假设是无效的。

 

由于油浸物镜的这种行为变得更加明显调查,被确认和三维成像研究活细胞和组织上的新兴技术的限制,一些显微镜制造商开始引入校正高数值孔径的水浸20世纪90年代中期的物镜。计划复消色差校正,数值孔径约1.2水浸物镜稍低的数值孔径值可比的油浸镜头,但添加允许200微米的顺序通过水层的高分辨率成像的关键能力的厚度。虽然水浸物镜的主要优点是改善了成像功能在低折射率的生物标本的厚制剂,以及其他的实际利益是来自于使用水作为浸没流体。水没有固有的荧光复杂图像解释,很少有污染的生理溶液的风险,水溶液中不要求特殊的清理方法,成本可忽略不计。

 

考虑井上伸也首次提出规范发展,高度纠正60X计划复消色差透镜水浸的目的所产生的尼康代表由其他制造商推出类似的物镜。的物镜具有1.2的数值孔径和工作距离为220微米,得到在该深度处的潜在图像的焦平面内的水传播的试样(见图1)。的校正环可以调整,以适应护罩玻璃的厚度从0.15毫米至0.18毫米,消除球面像差的一个基本特征。此外,该物镜从近紫外到红色的可见光光谱区域具有高传输和色差校正,因此,可以利用共聚焦显微镜和常规荧光和微分干涉相差(DIC)技术。

 

正如前面所讨论的,均匀的浸泡将确保光线偏转,直到达到物镜的第一透镜元件的后表面上,通过试样浸没介质的道路上。如果折射率接口被消除,物镜可被设计成在其整个聚焦范围达到衍射极限性能。低折射率的样品的水浸中的应用的更高折射率的浸没油消除了该问题,但如果水浸的目的是用来用护罩玻璃,玻璃和水的折射率之间的差被引入(图2( c)条)。确切的折射率和厚度的玻璃盖在实现最大分辨率变得至关重要,是许多水浸物镜的原因,包括不同的护罩玻璃性能的补偿校正衣领。光学塑料也可能是有用的减少安装介质和水物镜的浸没流体的折射率之间的不匹配。塑料盖眼镜,具有折射率在1.351.4之间的范围内显着降低,遍历从检体通过水性介质中的物镜前透镜元件的成像光线的折射角。

water immersion figure4

水浸物镜已经实用评测由许多研究者进行的,利用不同的方法来评估在某些应用中,这种类型的系统的好处。基于理论考虑的点扩散函数的球面像差的影响,清晰等优点水浸过油浸技术,生物研究的预测,尤其是样品平面玻璃盖一定距离。实验结果在很大程度上支持了理论预测,展示形象深入到水标本的能力,显着改善,结果与油浸物镜相比。

 

一个实验评估,在一个60X1.4数值孔径)计划复消色差透镜油浸物镜相比,进行了60倍的水浸计划复消色差透镜物镜1.2数值孔径,如上所述的性能成像测试物镜和高度详细硅藻在低于玻璃盖的各种距离(参见图4)。与理论预测的结果是一致的生产油浸物镜只有当试样直接接触玻璃盖均位于具有出色的分辨率和高对比度的图像,表现出严重的对比度下降时,各项指标均通过84微米成像水层。水浸物镜生产油浸物镜,相比稍低的分辨率和对比度,当物镜标本与玻璃盖接触,但图像质量保持层中加入水时,基本上没有降解的成像路径。

 

4展示的是与一个标准的60倍复消色差透镜1.4数值孔径的油浸物镜(图4a)和图4b))的结果相比,用一个60倍复消色差透镜1.2数值孔径的水浸的目的成像的星形测试物镜的中央部(图4c)和4D))。将试样制备(图4b)和图4d))与水或不带水(图4a)和图4c))之间的玻璃盖(170微米厚),测试物镜。在图4a)中,物镜图像被捕获的油浸物镜和测试物镜和护罩玻璃之间没有水。的对比度上面的半径为2.3微米,这对应于约0.2微米间距从中心消失。黑盘的中央有一个直径为1.2微米,以提供一个尺寸参考。当利用相同的物镜图像的物镜84微米之间的水的测试物镜和玻璃盖,对比度严重退化,低于0.4微米的间距变得不可见(图4b))。相比较而言,当测试物镜物镜之间的盖玻璃的水没有水浸物镜成像,对比度低于0.24微米的间距(图图4c))中消失。当与物镜之间的玻璃盖(类似于上面所讨论的油浸物镜),一个84微米的层的水被放置对比度仍然很高(图图4d)),水浸物镜的性能不会受到损害由玻璃盖和测试物镜之间的额外的水层。

 

示出的两个物镜的性能的定量评价图形的对比度传递函数的测试物镜组成的等距隔开的各空间频率(图5)的光与暗的酒吧。的对比度传输曲线图所示的光学系统是能够从物镜(试样)传输到图像物镜对比度的量(以百分比表示)。对于一个给定的空间频率的物镜保持充分的对比度的图像,将在图形上绘制为100%,较完善的对比度传递由系统。由于对比度下降在较高的空间频率,它最终会被减小到零,它可以被视为被评价的光学系统的分辨率的绝对限制在一个特定的行间距。每个图形显示在以下几种情况下产生的对比传递函数:没有水层之间的玻璃盖和测试光栅,并添加不同的水层厚度。此外,理论上计算出的对比度传递函数绘制相应的数值孔径为无像差的物镜。数据高达153微米的水被水浸的目的,而50微米的最大水厚度油浸物镜所示。

 

正如图5中所示,水浸的目的提供了对比度和分辨率的值几乎相当于理论极限,80153微米的水层中加入物镜试样和盖玻片之间,并保持其性能,仿真中遇到的情况深于水的材料,例如活细胞或组织成像。与此相反,油浸物镜表现出分辨率的限制减少了50%,严重退化的对比度进行测试时,只有50微米的水覆盖的物镜。的性能急剧下降,随着空间频率的增加。

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额外的评估已经证明的能力高数值孔径计划复消色差水浸物镜,获得高质量的图像深度为220微米的水,一个壮举,就根本不可能使用油浸物镜。执行其他调查测量的水浸物镜的点扩散函数,它支持的测试物镜的性能报告,并进一步说明焦点平面的上方和下方的功能改进的对称性的好处。的测量结果表明,随深度变化的失真可以建模和校正,使透镜可用于精确测量沿Ž轴垂直分辨率测定。的点扩展函数的客观事实,即上方和下方的焦平面(表示最小的球面像差)是对称的,使得它可以为目的,其数值孔径的理论计算的轴向分辨率相匹配。该光学性能的一个有利于整体施加到三维的试样相比,以相同的技术,利用油浸物镜在图像去卷积方法中是一个显着的改善。此外,基本消除水浸物镜的球面像差在改进的信号收集和图像的亮度时,在水深超过约20微米的在水介质中或组织的成像。

 

共聚焦显微镜的特殊方面

聚焦方法的主要好处包括控制焦平面厚度的限制,允许光学切片和改进消除耀斑图像平面外所产生的信号的分辨率和对比度。这两个因素综合起来,以允许提供的三维表示厚标本的XZ扫描图像。球面像差限制了这些功能,并在试样时,试样的折射率不同的浸没流体的深度成比例增加。如果油浸物镜用于与含水的试样,添加约三分之一波的球面像差为每微米聚焦深度低于玻璃盖。少量的球面像差引起的点扩展函数的扩展和等效轴向分辨率的损失(见图6)。累积超出约10微米,如果聚焦到一个低折射率的标本的很大程度的像差产生相当大的模糊的点扩散函数和图像中的对比度的损失。如果不消除球面像差,清晰度和对比度损失聚焦的方法覆盖任何利益成像时,在水深超过约15微米的玻璃盖。利用水浸物镜消除这些问题提供了实实在在的好处,如活细胞成像时,水标本。

 

折射率不匹配产生的球面像差,尺寸测量形态的误解和错误的程度,可以发生扭曲光学数据。众所周知的三维显微镜标本的失真表现为沿着光轴(z -轴)的伸长率功能。多项技术来衡量和计算模拟的效果,但超过的幅度和确切原因存在矛盾。的工件已实验验证,但是,已知会产生导致它的目的似乎是它的实际大小的3倍(图3)的轴向伸长。异常取决于浸没条件下,被认为是一个事实,即不会导致直接对应的焦点位置的位移的轴向阶段的活动所造成的。估计距离和体积的错误发生,在各种形式的三维定量显微镜具有重大影响。其中,已被证明在失真效果方面发挥作用的因素是嵌入或周围的介质中和浸没流体,试样尺寸,玻璃盖之间的距离,和物镜的数值孔径的折射率之间的不匹配。利用水浸成像低折射率的标本,如生物材料时,将减轻的效果,虽然在某些条件下,将不能完全消除。细胞物质通常在约1.331.39之间的折射率变化,因此一些折射率的不匹配可能仍然存在,即使当使用水作为液浸介质。

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除了尺寸缩放的折射率不匹配时发生的错误,可以由相同的点扩散函数的扭曲引起的信号强度的显着影响。许多共聚焦系统的配置,扫描整个试样的照明针孔利用在检测路径,被扫描的目的不包括所有来自检测器的光聚焦在相同的机制。深内的试样,利用油浸物镜成像时,球面像差的严重程度,可引起足够的焦点偏移,大部分试样中由荧光团发射的光不能穿过针孔探测器。因此,大多数达到共焦检测器所发射的信号从玻璃盖除去试样的区域之前丢失。伴随着强度的损失,在所获取的图像的球面像差引起的焦点偏移,并继续减少几何距离成试样。

 

发布的理论和实验分析确认了1.3数值孔径的油浸物镜,成像深20微米的荧光平面内的水介质中,检测峰强度低于40%,从飞机10 - 千分尺的深度。这个概念是在图6中示出,其中显示高数值孔径的油浸物镜,和其相应的轴向响应的共焦的点扩散函数的等高线图,在水中的一些成像深度。在图6a)的理想的点扩散函数(无球面像差),而成像深度为51015,和20微米到含水介质中的图中示出图6b-6(五)元。通过应用高数值孔径的水浸的目的是减少或消除球面像差的有效途径,以保持足够的信号电平在高分辨率荧光显微镜。

 

一个经常被忽视的优点,使用共焦技术中的水浸物镜是,水是粘滞性大大小于大多数浸没油,因而在聚焦过程中,当物镜和试样的制备相对位移施加较小的力(表面张力),在玻璃盖给对方。玻璃盖,因此,不太可能弯曲可能位移改变焦点时,在采集过程中的共焦的z系列试样。在反复的重新调整,需要在光学切片标本最小化运动可能会导致更清晰,更有意义的三维重建图像的堆栈。

 

最近,水浸物镜已被实验证明是适用于多个物镜4Pi共聚焦显微镜和θ显微镜技术如。的4Pi共焦显微镜中实现类似的轴向分辨率的近场光学技术,是通过从两个相对的高孔径物镜相干聚焦的球形波阵面的组合。两个球面波阵面的结果,在增加孔径沿着光轴,和较窄的点扩散函数的最小的相干叠加。这种技术产生了最高的三维日期,这是在100纳米的结合图像重建的顺序得到的远场的分辨率。

 

高数值孔径的水浸物镜的发展之前,浸油的依赖有限4PI的共聚焦显微镜以甘油装标本。甘油(1.47)的折射率被充分地靠近浸油(1.51),因此,最小的轴向扫描过程中所需的相移补偿。细胞研究的很大一部分涉及基于甘油的安装媒体,和至少一个制造商已经开发出了高数值孔径的甘油浸泡的目的,以尽量减少从油甘油的折射率不匹配所导致的数据的降解。专为使用石英玻璃盖(折射率1.46),镜头采用了一个的像差校正领容纳甘油浓度在72%和88%之间。这一物镜已被成功地应用在三维荧光显微镜,应该简化甘油装标本的4Pi显微镜。

 

到水或生理溶液中,然而,严重的球面象差和相移的情况下,在深度成像在不允许的4Pi显微镜浸油或甘油浸没物镜进行。因此,油浸泡4PI方法并不适用于活细胞成像。高孔径的水浸物镜,以尽量减少球面像差引起的折射率不匹配扭曲传统的共聚焦和多光子成像提供相同的优点在4PI应用于活细胞研究的方法。虽然水浸物镜比可比油浸镜头具有较低的数值孔径,一些研究已经证明,他们产生有利的点扩散函数的特性,它允许在三维成像的活标本利用4PI显微镜轴向分辨率根本好转。