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奥林巴斯显微镜:荧光激发和发射基本面概述

2013-10-16  发布者:admin 

由于其新颖的电子配置,荧光染料有独特的特征吸收光谱(通常是类似的激发)和发射。这些吸收光谱和发射光谱表明相对强度的荧光,与经典的相对强度与波长在横轴上绘制在垂直轴。对于一个给定的荧光染料,制造商指示的照明激发光强度和荧光的发光强度的峰值波长为峰值波长。重要的是要了解显示对于一个给定的荧光染料的激发和发射光谱的图表和曲线的原点。

excitation emission figure1

为了确定一个特定的荧光染料的最大吸收波长(通常是相同的激发最大值)的发射光谱来确定,并在该波长下被激发的荧光。一个典型的荧光染料的吸收光谱示出在图1(a)如吸收的相对强度对测得的波长作图。甲单色仪(一种装置,允许通过的窄频带的光的波长),然后用于扫描的荧光发射强度,发射波长在整个系列。荧光的相对强度的测量是在不同波长绘制的发射光谱,图1(b)中示出。以相似的方式确定一个给定的荧光染料的激发光谱的最大强度的波长,而通过一组连续的波长激发荧光团的荧光发射通过监测。其最大发射选择,唯一的排放物在该波长的光传递给探测器。激发诱导(通常是通过单色仪),在不同的激发波长所发射的荧光的强度作为波长的函数的测量。其结果是一个图形或曲线(图1(a)中示出),示出在光谱的激发波长的激发所产生的相对荧光强度。

以下几点结论:可以从一个典型的曲线或光谱的激发波长和发射集。通常有较高的波长的激发光谱和结束的下的发射光谱的波长端之间的重叠。必须消除这种重叠激发和发射强度和波长(图1(c)中示出),在荧光显微镜中,激发光滤光片,二色光束分离器(在反射光中的荧光)的适当选择,通过阻挡或发射过滤。否则,激发光更亮淹没弱荧光发射光,并大大减少了标本的对比。

当电子从激发态到基态(见下面一节题为“ 分子解释),有一个振动能量损失。其结果是,被移动到更长的波长比激发光谱(波长成反比的辐射能量)的发射光谱。这种现象被称为斯托克斯“斯托克斯位移。斯托克斯位移(Stokes shift)越大,越容易分开激励光从发射光。的发光强度的峰值通常是低于激发峰,发射曲线的往往是激发曲线的镜像图像,但转移到更长的波长。为了实现最大荧光强度,荧光染料通常是在该波长激发激发曲线的峰值,选择在发射曲线的峰值波长(或观察者所选择的其它波长的光)的发光检测。的激发波长和发射波长的选择控制的适当的过滤器。在确定的光学系统的光谱响应,技术修改需要考虑到对于不同波长的玻璃传输和检测器的灵敏度变量等因素。

excitation emission figure2

在图2中示出一个典型的荧光染料吸收的发光光谱图。请注意,这个典型的荧光吸收(通常是相似的纯化合物的激发曲线)和发射荧光强度的曲线形状有几分相似。一直被称为十九世纪中期以来,(Stokes定律)之间的激发和发射波长移位。另外请注意,激发和发射曲线的上端处的激发和发射曲线的较低的波长有所重叠。

激发和发射波长的分离是通过选择适当的过滤器,如在图3中以阻止或通过特定波长的光谱。荧光照明器的设计是基于容易地更换过滤器插入到光路的方式向试样的激发光和发射光的控制,然后由试样放出。中的发光强度低,这是很重要的,选择的激发光源是足够的亮度,因此,可以最大化的发光相对较弱的,令人满意的吸收和生物产量,荧光染料的选择。

excitation emission figure3

被称为消光系数的荧光染料吸收的激发光的效率的。消光系数越大,在一个给定的波长区域(随后的荧光发射的一个先决条件)的光吸收的可能性就越大。发射的光的产率被称为量子数之比(“数据包”的能量)的量子产率,发射量子吸收(通常产率是0.1和0.9之间)的数量相比。低于1的量子产率是能量的损失通过非辐射途径(如热或光化学反应),而不是重新辐射通路的荧光的结果。在表1下面列出的一组选定的荧光染料的荧光量子产率。请注意,一些量子产率似乎微不足道(苯),而别人是非常有效的(荧光素和罗丹明-B)。

荧光的荧光量子产率

复合

溶剂

激发
波长
(纳米)

发射
波长
(纳米)

量子产率

吖啶橙

乙醇

493

535

0.46

乙醇

248

300-350

0.04

叶绿素a

乙醇

440

685

0.23

曙红

521

544

0.16

荧光

437

515

0.92

罗丹明-B

乙醇

555

627

0.97

表1

消光系数,量子产率,平均的光源的发光强度,荧光寿命的荧光发射的强度和实用程序的所有重要因素。此外,局部地区的环境周围的荧光染料中起着极其重要的作用,在确定的荧光发射的特征。溶剂的粘度,离子浓度,pH值,和疏水性环境中的变量,如可以有深远的影响的荧光强度和激发态的寿命。

荧光分子解释

图解方式示于图4(a)(称为雅布隆斯基能量图),有时被描述荧光活性。激发之前,被描述为在基态的分子的电子组态。吸收的激发光的光子,通常短的波长时,电子可以被提高到一个更高的能量和振动激发态,一个过程,可能只需要一千万亿分之一的第二期间(时间段通常被称为飞秒,10E 15秒)。

excitation emission figure4

荧光,期间间隔约一万亿第二(一皮秒或10E-12秒),被激发的电子可能会失去一些振动能量对周围环境和返回到了什么叫做最低激发单重态。从最低激发单重态的电子是“放松”返回到基态时,如在图4中示出与同时发射的荧光光(一)。所发射的光总是比波长较长的激发光(斯托克斯定律)和继续,只要激发照明沐浴荧光试样。如果被中止,令人兴奋的辐射荧光停止。

有时候被激发的电子,而不是的放松的最低单重态,可通过振动相互作用,使一个禁戒跃迁到退出的三重态,然后到基态的过程中,辐射的发射可能大大延迟几秒钟,或以上。这种现象是磷光特性,图4(b)所示。在某些情况下,被激发的电子可以从三重态的最低激发单重态,然后返回到基态,随后发出荧光。这个动作需要较长的时间比平常荧光(约一两微秒),被称为延迟荧光(图4(c))。在其他情况下(例如,光漂白或盐,重金属或其他化学品的存在下),发出的光可能会被显着减少或完全停止,如下文所述。

衰退或漂白

有一些特定的条件下可能影响再辐射的光激发荧光,从而降低荧光强度。这种减少的发光强度通常被称为衰退漂白。一些学者进一步细分变为淬灭和漂白。漂白的荧光分子,因为在分子氧存在下的光强度是不可逆的分解。淬灭也导致荧光强度的减少和经常作为氧化剂或重金属或卤素化合物的盐的存在下的结果带来的。

通常情况下,淬灭结果的能量转移到其他受体分子物理激发荧光基团,这种现象被称为共振能量转移。这种特殊的现象已成为一个较新的技术,测量距离远低于在光学显微镜的横向分辨率的基础。

漂白的发生,导致FRAP,恢复或荧光漂白后,被称为一种技术。FRAP是基于激光短脉冲串和随后的恢复引起的扩散到漂白区域的荧光基团的荧光观察漂白。

热门抗淬灭试剂的属性

抗淬灭试剂

评论

对-亚苯基
二胺

最有效的试剂FITC。罗丹明也有效。应调整到0.1%甘油/ PBS中使用对苯二胺。试剂变黑受到光线照射时,它应该被保存在一个黑暗的地方。皮肤接触是极其危险的。

DABCO
(1,4 - diazabi- 
环-2,2,2 - 
辛烷)

高效FITC。虽然其效果是稍低于对 - 苯二胺,它更耐强光,并具有更高的安全水平。

正丙酯

最有效的试剂,罗丹明,FITC标记也是有效的。应调整到1%甘油/ PBS中使用子酸丙酯(PG)。

2 -巯基
乙胺

用来遵守染色体和DNA标本染色用碘化丙啶,吖啶橙,或Chromomysin A3。应调整,以0.1mM的2 - mercaptotheylamine在Tris-EDTA

表2

为了减少在某些试样的衰退程度,它可能是在光路中,最好使用中性密度过滤器之前的照明达到激发光滤光片,从而减少激发光的强度。在其他情况下,可能会降低衰落的影响,通过改变安装介质的pH值,或通过使用抗漂白剂(表2中列出了一些比较重要的代理)。对于数字成像,显微摄影,或简单地目视观察,迅速变化的视场也可避免衰退效果。