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奥林巴斯显微镜:霍夫曼调制对比的结构

2013-10-16  发布者:admin 

霍夫曼调制对比系统,旨在提高可见度和对比度染色的和有生命的物质,通过检测光梯度(或斜坡),并把它们转换成光强度的变化。罗伯特·霍夫曼博士在1975年发明了这种技术,并采用了几个配件,已经适应了一些商业显微镜。

hoffman figure1

霍夫曼调制对比度的基本显微镜的配置在图1中示出。一种光振幅空间滤波器,被称为“ 调制的霍夫曼被插入一个消色差透镜或平场消色差物镜的后焦平面上(虽然也可以用于更高的修正)。通过本系统的光强度变化的上方和下方的平均的值,它的定义,然后,所述待调制。用于调制对比度的物镜可以涵盖整个10倍到100倍的放大倍率范围。调制器具有图2中描绘的三个区域:一个小的,暗区的外周附近的后焦平面上,其中只有1%的光(在图2中标记为“ D 的区域)发送;一个狭窄的灰区发送15 %(在图2中标记为“G的区域)和剩余的清晰或透明的区域,覆盖大部分领土在后面的物镜,即100%的光(在图2中标记为“B的区域)发送。相衬显微镜中的相位板不同,霍夫曼调制器被设计成不改变相位的任何区域的光线穿过。下观察时,调节对比度光学系统,透明的对象,基本上是无形的,在普通的明场显微镜相梯度决定一个明显的三维外观。该调制器不介绍在通过调制器的不同部分的光通过的相位关系的变化,但影响的主要的零阶最大值。高阶衍射极大值不会受到影响。使用迈克耳逊干涉仪的测量证实了,通过霍夫曼风格的调制器通过的光的相位变化而变化(如果有的话)由小于λ/20的一个因素。

modulator

下面的阶段,一个聚光镜与旋转炮塔利用持有的霍夫曼调制对比度系统的其余组件。炮塔的聚光镜有一个明场开幕孔径光阑,光圈进行定期的明场显微镜和校准,并建立适当的条件下,科勒照明的显微镜。在每个其他炮塔的开口,有一个偏离中心的狭缝部分地覆盖有一个长方形的小型偏振片。狭缝的大小/偏振器的组合是为每一个物镜的不同的放大倍率不同,因此需要的转台安排。

霍夫曼的设计是这样的,狭缝位于聚光镜的前焦平面中,如在图1和图3中示出。当光线穿过的离轴的狭缝,这是在其中已经安装了该调制器的物镜(也称为傅里叶平面)的后焦平面成像。包含离轴的狭缝板的聚光镜的前焦面光学共轭客观后焦平面中的调制器。图像强度的一阶导数中的切片的光密度成比例,并控制相位梯度的零阶衍射图案。

principle

调制对比度的原理提供用于至少两个基本调制器,在图2和图3中示出的狭缝板配置。本讨论的目的,被夸大和附图的图2中所示的调制器板的尺寸增大。图2和图3(图2(a)和图3(a))中的左侧上的安排是一个对称的系统,其中调制器灰色条纹和狭缝被放置在显微镜的光学轴(中心)。在这个系统中的分辨率被限制为:

分辨率=λ/ NA

其中NA是数值孔径的物镜λ等于波长的成像光源的平均。暗(1%的透射率)和轻的或透明的(100%的透射率)的区域大小是相同的,而灰色区(15%的透射率)是在一个狭窄的条纹形式的,出射光瞳的直径是10%的的物镜。其他结构(图2(b)和图3(b))是不对称的或偏移量,其中该调制器的暗区位于外部的出射光瞳的物镜。在本系统中的分辨率大大改善和方法:

分辨率=λ/ 2(NA)

NAλ的值是相同的,如上面所述。分辨率中的偏移量的系统(图图3(b)),这是显而易见的,几乎是一样好,在中央系统(图3(a))的两倍。的透明(清除)区域中的偏移量的系统中,填充与填充其他的10%的灰色区和暗区的物镜出射光瞳的直径几乎90%的。

下面的聚光镜,一个圆偏振器被放置在显微镜的光出射端口的(注意,这两个偏振器是低于切片)。该偏振片的旋转,可以控制的狭缝开口的有效宽度。例如,一个“交叉”的两个偏振器,在90度到每个其他的查询结果中的“缩小”的狭缝,以便其图像范围内,如在图3中所示的调制器的灰色区域,。偏振器所控制的狭缝寄存器的部分的调制器上的亮区。由于偏振器是旋转,对比度可以改变以获得最佳效果。一个很窄的狭缝产生图像在对比中等程度的连贯性是非常高的。光学部成像的狭缝时,被调整到其最窄的位置,也进行了优化。当圆偏振器的取向,其振动方向平行于偏振片在狭缝,有效的狭缝宽度是处于最大值。这降低了整体图像的对比度和连贯性,但能够产生更好的图像较厚的物体的折射率存在较大的差异。

早期设计的调制对比度系统没有利用显微镜光端口上的狭缝偏振器或圆偏振器,并且如在图4中所示为一个对称的配置依赖于单个大小的狭缝。在该图中,来自源的光通过一个固定的光圈的狭缝(称为“狭缝板”中的人物),然后通过检体含有相梯度。这些梯度偏转光,根据方向的梯度,进入的明确或暗区的对称式调制器,其定位在后方的物镜的焦平面。所得到的图像显示了一个简单的对比度是由样品中的定位和斜率相梯度决定。

modulationpaths

在现代先进调制对比度系统中,调制器和该狭缝显微镜的光轴偏离。这种安排允许良好的分辨率和细节中的物镜和结果的数值孔径的更充分地利用。中呈现的阴影,伪三维的外观形状和细节。这些出现的一侧上,在中央部的灰,而较暗的另一侧,一个灰色背景亮。该调制器的细节(陡度,坡度,折射率,或厚度在试片细节的变化率)的光相位梯度转换到目镜膜片的平面中的不同的图像区域的强度变化。由此产生的图像与光学梯度方向敏感性有一个明显的三维外观。

对面梯度偏转的狭缝图像非常暗的部分的调制器或调制器的明亮部分,如在图5中示出的结果。在该图中,假设检体含有正面和负面的相位(厚度)的梯度和一个平面(非梯度)区域的成像使用调制对比度光学元件。在图5中所示的负梯度(一)偏转的调制器,它是衰减至约1%的前一个值的暗区的光进入。同样,在图5(c),由正梯度进入调制器的透明区偏转的光不衰减,和100%,该光被发送到中间图像平面。任何非梯度的切片的一部分(图5(b))和背景(环绕)上注册的灰色部分的调制器,其中约15%的光被发送到中间图像平面。其结果是,从一个侧面的梯度强度的图像区域是暗的。从相反侧的渐变的强度产生一个明亮的图像区域,和非梯度的区域在图像上显示为灰色,一样的背景。

对灰色的黑暗和明亮区域的对比度(与强度变化)给出了阴影伪浮雕效果。这是典型的调制对比度的成像。偏振片的旋转改变取得的对比度,在舞台上的检体(相对于偏振器和偏移量的狭缝)的取向可能会显着提高或降低对比度。

phasegradients

由于调制器的影响的狭缝的图像根据如何切片的详细信息转移的图像的狭缝(和因此在改变光强度的结果),它描述一个振幅滤波器。 霍夫曼和其他人已表明,相梯度在切片类似的空间频率,分布在整个出射光瞳的客观。的调制器的光传输强度分布将提供各种各样的对象的令人满意的图像,产生相位梯度,包括:所有类型的细胞和组织(两个活,染色和未染色),和表面细节的晶体的,透明的聚合物,眼镜及其他类似材料。也是有用的成像在不透明和冶金标本和表面细节的复杂的集成电路和其它电子材料的晶粒边界的反射光的调节对比度显微镜观察。

有许多优点和局限性调制对比度。的一些优点包括更充分地利用物镜屈服的细节,以及良好的标本对比度和可见性优异的分辨率的数值孔径。虽然许多标准的调制对比度物镜消色差或平场消色差,但也可以使用具有更高程度的校正光学像差,如上面所讨论的物镜。许多主要的显微镜制造商现在提供荧光校正等级的调制对比度的物镜,并可以通过特殊订单消色差。较旧的物镜往往可以加装调制器的调制光学公司,该公司成立由罗伯特·霍夫曼博士,专门建立售后和自定义的系统。

除了使用更高的数值孔径与调制对比度的优点,但也可以使用这种技术指南“ 光学切片 “。剖分允许显微镜技术集中在一个单一的薄膜平面的切片从混乱的图像所产生的区域的平面的上方或下方,正集中在无干扰。显微镜的光轴平行的方向上测量的切片的深度。对焦的图像建立正确的切片至图像距离,允许发生的衍射波的干扰,在一个预先确定的平面(图像平面)定位在一个固定的距离从目镜。这使得衍射要观看的对象发生在切片中的不同深度的水平分开,只要有足够的对比度。可以通过顺序后面的每一平面上聚焦光学剖切片的整个深度。在这个系统中,定义为从一个层次到的距离的下一个发生的不同的细节成像景深,以及所控制的物镜的数值孔径。更高的数值孔径物镜表现出非常浅的景深,并,相反拥有较低的数值孔径为物镜。一个客观的隔离和集中在一个特定的光学部分的综合能力的光学均匀性的标本下降而减小。

图像出现阴影或伪三维,提高可见性,因为在任一侧上的一个细节的对比度差异。客人没有光晕图像中表现出不同,产生的图像与相衬光学。调制对比度的相位梯度转换成幅度信息的差异是非常不同的相位关系变化(和光程差),所产生的相衬显微镜。使用的的暗灰色地带,在调制器产生的图像包含深浅不一的灰色,并没有彩色。通过生产具有同等的透射率值的彩色区取代灰色区和暗区的调制器,它有可能引入到调制对比度的图像的颜色。在这种情况下,从相位梯度产生的图像呈现相似的梯度具有相同的色调的颜色。目前,我们不知道任何商业来源,包含彩色区域的调制滤波器。

 

 

消色差或平场消色差调制对比显微镜使用最广泛的物镜,因为他们可以得到很好的图像,因为颜色不参与。用绿色滤光器(划归偏振片)使用这些物镜,将进一步改善图像因为消色差透镜球面校正绿光。更高的校正,包括荧光消色差物镜也可以被用于调节对比度显微镜观察,但增加的费用往往是不值得的图像质量的提高,除了在非常高的放大倍数。

 

调制对比度配件的成本大大低于微分干涉相差(DIC)的设备。虽然这两种方法都需要转台聚光镜与相匹配的每一个物镜的组件,DIC-设备齐全的显微镜还包含下面的聚光镜和一个之前被放置在光路中的中间像平面(上面的物镜)的分析仪,偏振器。存在的交叉极化系统,DIC显微镜所必需的,削弱其效力的样品反应偏振光。

切片没有位于两个偏振器之间的,双折射对象(岩石薄片,晶体,骨等),可以混淆在DIC的图像,可以被检查。另外,切片可以包含不劣化的情况下的图像,因为极化效应的塑料或玻璃容器中,因为这样的船只,也都超过这两个偏振器中,而不是在它们之间。这使得霍夫曼系统更有用的细胞,组织和器官培养在塑料容器中进行检查和显微摄影比DIC。

聚光镜设置在明视场的位置,也可以被用于安装一个调制器的物镜进行常规的明场工作。由于调制器是离轴,劣化少的图像的结果。物镜(但不是狭缝板聚光镜)装有一个调制器也可以被用于荧光和暗场工作,但这些物镜时,应避免尝试DIC的显微镜。的调制对比度系统已非常成功地使用用偏光镜,以提高检测的两个光学梯度和切片中的双折射性。在此应用中,使用非偏振光的狭缝和偏振光配置应该是平行的偏振器(虽然划线偏振片也将产生良好的结果,但与减少的照明)。调制对比度改性的一个目的,是非常有用的,使用普通的偏振光照明而不在聚光镜中的狭缝板。

霍夫曼调制对比系统也有几个缺点和限制。图片必须谨慎对待,因为不同的观察者可以“看到”的“山”中的形象为“谷”,反之亦然伪三维图像,通过目镜观察。垂直于狭缝的长度,从而在一定程度的技术人员以取得最佳效果的检体的取向的要求,该系统是最敏感的梯度。

每个物镜聚光镜开口变形的成本必须被添加到这些配件本身的基本成本。复杂的,高的数值孔径,多元素的物镜是困难或太昂贵的修改。在最近几年中,罗伯特·霍夫曼的公司,调制光学的颐,纽约(的全资附属斜翅片公司),已修改的物镜聚光镜。光学调制专门修改领先的显微镜制造商生产的物镜。有些物镜很容易修改,而另一些则很难或不可能修改的调制光学规格。然而,可用于任何物镜公司的中间管系统,包括一个广泛的范围跨越100倍的显微镜物镜的宏观相机镜头之一。也包括在这一类的干或浸泡媒体的形象标本(油,水和甘油),单个和多个波长的物镜,反射和透射光的物镜,和物镜校正无论是无穷大或有限的管长度设计的物镜。调制光学设计和制造自己的聚光镜的系统,以满足广泛的数值孔径和工作距离组合。

非吸收切片不会呈现在颜色,与观察到的包含半透明的彩色滤光片中的灰色区和暗区的地方的使用一个特殊的调制器的异常。呈现出的切片,自然吸收的特定波长或淡染的颜色以及与调制对比度和荧光的组合或与组合的调制信号的对比度和偏振光观察到的那些。

霍夫曼调制对比度显微镜的配置是直线前进,基本步骤概括如下:

霍夫曼调制对比度在透射光

· 显微镜的物镜转换器,将相关的调制对比度功能的物镜,并包含适当的缝隙板安装在炮塔聚光镜。如果在显微镜配备作微分干涉相差(DIC)或偏光显微镜,去除所有的偏光板,相位差板,和渥拉斯顿或利用Nomarski棱镜从光路。

· 在舞台上放置一个染色标本(最好是一个组织薄片),并使用10倍的物镜(安装调制器),在显微镜对准适当的科勒照明在我们上解剖显微镜的部分,概述。调节对比度狭缝板应该从聚光镜进行此操作。,如果炮塔聚光镜有一个明场照明孔径光阑位置,旋转炮塔选择这聚光镜

· 查看的调制器的板的后焦平面上的物镜,使用伯川德透镜(常见的偏振光显微镜),一个相位望远镜,或者通过简单地除去的目镜和对等的眼睛管。请某些该样本是从光路中,或者它被移动到一个明确区域的显微镜载玻片上除去。

· 选择的狭缝板,其对应于通过移动到光路中的适当的聚光镜(从转盘)10x物镜。应该有一组调整螺钉或杆,使得聚光镜内的照明狭缝板的旋转和平移。

· 将圆偏光显微镜的光过滤器,聚光镜下方的端口。此过滤器旋转,同时观察通过伯特兰透镜(或相位望远镜)的狭缝图像,并观察到的旋转角度影响的光量(亮度),通过偏振器的狭缝部分。

· 翻译的狭缝,使得开口部缺乏偏振片叠加在灰色区域,如在图3(b)中所示的调制器板的图像。含有偏振材料的狭缝的部分应当被成像在清澈的调制器部分的灰色区域正右方。旋转的圆形的偏振滤光器,并观察含有偏振材料的狭缝的区域如何出现和消失。当的圆偏振器的振动面垂直方向取向的偏振器的振动面的狭缝,狭缝的大小,如果最小化,并得到最大的对比度。这个动作可以练习使用的互动Java教程:

 

 

· 删除伯特兰透镜或相望远镜和,更换的眼睛管显微镜的目镜。标本放置在舞台上的候选人,与10倍的物镜和重点。

 

· 重新调整视场光阑调整聚光镜的位置,以获得清晰的对焦。打开明场孔径光阑,直到它外面的视野。

· 现在已经准备好观察和显微摄影与调制对比度的图像。旋转的检体和/或圆偏振器的显微镜的基础上,以实现最佳的对比度。这些设置会有所不同标本标本。

· 重复上面的步骤,每次不同的放大倍率选择用于观看的切片调制对比度。

再一次,我们发现,操纵光的聚光镜的前焦面(由装置的一个偏移量的狭缝)和操纵的光的后焦平面上的物镜(偏移调制器)可以有一个显着的效果呈现的图像时在目镜。