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尼康显微镜:活细胞成像的培养室

2013-10-16  发布者:admin 

标本室是一个不可或缺的关键分支,在活细胞成像的历史和广泛的设计描述系统,提供卓越的光学性能,同时允许不同时间量要保持标本多年来已经发布。从密封盖玻片载玻片上,使几乎所有的环境变量的严格控制到复杂的灌注室编写的简单的复杂程度不等,培养室被设计为,允许活标本观察微创高分辨率。

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不管他们的设计,活细胞成像室必须满足各种要求,才能被成功地应用在实验中。应易于消毒室,实验室环境完全隔离观察期间尽量减少暴露在污染源有盖或密封。另一方面,培养室还提供细胞的不复杂的进入,如果调查涉及显微注射,加入的试剂(如药物或代谢物),细胞的物理处理,或向培养基中的变化。如果随后通过克隆或合成荧光或免疫荧光成像结束后,固定和染色的培养的活细胞的实验中,腔室必须被配置为允许去除盖玻片。

 

培养室的尺寸,其中包括整体的大小,比表面积大的细胞培养,冲洗细胞介质(或缓冲液)的体积,是重要的考虑因素。除了容易地被容纳的显微镜载物台,培养室必须足够大,在其横向尺寸来作详细的采样人口中包含了足够的细胞。周围介质的深度应最小化,以确保最高的可能性光学透射光的质量和辅助细胞,但它也必须足够深,以提供一个健康的环境。塑料盖玻片应避免由于其固有的自体荧光和应变双折射,干扰某些成像模式。只有最高质量的盖玻片应,应具有较强的酸或碱清洗和彻底清洗。商业培养室的可靠性,通用性和成本变化。,以确定是否需要一个复杂的(通常是昂贵的)的腔室,或者如果更大数量的简单的培养皿就足够了设计实验时,应考虑这些因素。在最后的分析中,应该认识到,没有完美的培养室的所有宗旨和许多妥协往往是必要的,以实现活细胞成像的成功。

 

两个高性能的商业孵化和灌注商会为活细胞成像,如图1所示。在图1a)的开放室系统被设计为用于与具有稠合到基座的盖玻片的35毫米的培养皿中,并设有为-550摄氏度的工作温度控制在一个范围内的珀耳帖热泵。多个的灌注系统选项启用连续灌注在一个恒定的温度,连续灌注,静态孵化培养基(无灌注),通过灌注温度急剧变化或引进。腔室的流体的高度调整用螺杆机构连接的吸入口,消除了交换介质的过程中,流体扑。腔室还配备了一个单一的通道补丁夹紧耦合到涂有聚四氟乙烯的以及具有氯化银电极,以形成盐桥,在要求低噪音的电生理学实验。气体流过腔顶部提供了改进的温度均匀性和pH值控制。在图1b)的封闭小室系统包含一个独特的双重角色灌注系统,在该系统中,是由介质的控制数据流在一个通道的载玻片(称为微渡槽)也涂有导电层流透明的铟锡氧化物薄膜进行温度控制。该系统可以工作流率从静态通过快速的介质交流与细胞表面的低剪切跨越一个温度从环境温度到50摄氏度。碳酸氢盐和有机缓冲液是兼容的腔室,这是连接到一个独立的控制器单元。

 

历史视角

第一个活细胞成像室设计和建造后不久,哺乳动物细胞培养技术开发二十世纪初。这些早期的室利用燃烧芯,来控制流动的介质通过的玻璃窗的玻璃容器或软木外壳。最终,一些灌注式生长室构造的意图被用于使用光学显微镜的时期内可获得长期的成像。到了20世纪50年代和60年代,更复杂的活细胞成像室被设计用于高分辨率的调查,纳入相位和微分干涉对比显微镜(DIC)的新兴技术。负担得起的技术和耦合器交配电影胶片相机与显微镜的完善,在20世纪60年代末和70年代初,研究人员能够系统地调查时间推移实验中的活细胞高时空分辨率,使用越来越复杂的成像室。

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成像室,在20世纪70年代和80年代开发的,基于标准的设计涉及两个盖玻片,橡胶O型圈或类似垫片由一对分开,成架制成的两个金属板夹层。这种常见的动机,遭受一些陷阱,包括无法交换培养基或添加测得的药物或代谢物的等分试样,盛行了很多年。更先进的灌注腔最终构建通过修改这个基本的设计,以使连续加入新鲜的培养基和其它试剂的间歇添加。然而,许多这些早期的腔室的设计,主要的缺点是缺乏注意层流,化学梯度的形成最小化的一种方法,其中通过作为介质的平稳过渡将被替换。层流,确保两个解决方案不成为湍流混合在更换过程中,以避免生成的化学梯度。既简单又复杂的成像商会在过去几年的持续发展,导致优秀的设计,适合大多数成像方案的要求。

 

几个活细胞成像室最初被设计在20世纪后期,如图2所示。这些腔室的变化是可商购的,衍生的配置已在许多实验室中构建。在图2a)所示腔室罗伯特·天艾伦和Andrew鲍耶尔从原设计的是一个第二代的版本,并在灌注实验中使用的一个直立显微镜的目的。大直径排气口的机会减少开裂的盖玻片,并可以轻松地修改以适应一个倒置的组织培养仪室。虽然价格相对低廉的建立,这间密室不会产生理想的层流特性。德沃夏克Stotler室风格呈现在图2b),设有圆形盖玻片和垫圈,定期市售的几个厂家,但也比较容易构建。在每小时1毫升灌注率,在德沃夏克Stotler室产生一个干净的盖玻片表面流过,清扫模式。图2c)代表了一个复杂的设计在20世纪50年代初,最初是从研磨抛光有机玻璃灌注室的透视图。启用的标本,在高分辨率下连续灌注的能力,这种设计的缺点是缺乏令人满意的层流特性。图2给出了该商会代表在文献中出现的许多设计在过去的50年,只有少数几个。

 

如今,活细胞成像室广泛商业化,从简单的设计,安装在显微镜玻片上,复杂的系统,能够控制几乎所有方面的环境。虽然许多研究者(特别是那些获得的机修车间)继续他们的实验,以满足特定的要求专门制作室,现在商会广泛的支配单位,拥有先进的层流,聚合物建设,以及高清晰度的能力以合理的成本可购买的。强调的是,任何培养室的设计的最重要的方面是要能够保证和验证,细胞培养是健康的,处于正常的时间刻度上的增长,以及提供足够的显微镜的光学窗口,以确保培养成像可以在足够高的数值孔径的实验,以满足分辨率的要求进行。

 

简单的显微镜载玻片和培养皿成像

短期成像实验中(2030分钟或更小),可以简单地进行附加到载玻片含有贴壁细胞的盖玻片,使用隔离物,以保持细胞的损坏(物理应激可诱导某些细胞系中的自发荧光)。能够确保盖玻片与一些密封剂,包括熔化的琼脂糖,橡皮泥,真空润滑脂,或一个有用的制剂称为VALAP(凡士林,羊毛脂,石蜡的1:1:1的混合物)的任何一个,以提供水密密封和消除培养基中(图3a)中示出)的蒸发。由硅橡胶(市售)或碎片的盖玻片的切薄的垫片,可以用作隔离物,以保持细胞的直接接触的显微镜载片上(图3b))。组装时这些腔,使盖玻片表面含有细胞正面朝下放置在隔板上,并填写盖玻片和载玻片之间的空隙用生理缓冲液(如磷酸盐缓冲液PBS)或营养组织培养基。密封盖玻片的边缘周围使用的试剂的选择,并在舞台上观察放置在显微镜载片上。细胞在生长培养基中,温度控制的情况下,将正常的只有几分钟,但是这往往是足够的时间来获得必要的图。于短期存储,而不会严重影响细胞生存力,滑动被放置在二氧化碳培养箱或旁边的显微镜图像采集会话之间的一个小加热块。此外,为了避免在储存过程中损失的缓冲区或培养基中实验之间,滑动可以放置在一个小的加热湿度室。

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合成的O形环(图3c))或类似形状的圆形垫片(如三孔活页夹用于加固片)提供了一个方便的替代平面硅胶垫片(图3b)),并且可以很容易地密封与上面所讨论的任何安装的混合物。在许多情况下,圆形垫片足够厚,以增加量的介质或缓冲区可用洗澡的细胞,细胞损伤的风险是少安装时。含有贴壁细胞,薄的组织切片,胚胎,或小的完整的生物体的盖玻片往往可以更容易地成像代较厚的单井凹的载玻片是标准的载玻片(图第3d))。这些载玻片3毫米厚(1毫米的传统玻璃载玻片),使他们能够适应有比较深的腔(2毫米)。的以及拥有更大体积的缓冲液或者培养基中相比,可以夹着平坦的滑动和盖玻片和类似的O型圈,将不太可能在安装过程中对细胞造成损害,抑郁症。在下行路上,厚厚的设计和弧形墙壁是不兼容传输高分辨率成像对比增强(相衬,DIC,霍夫曼调制对比HMC)模式。但是,荧光成像,这依赖于落射照明的盖玻片,是不会受到井。

 

在前面的段落所描述的简单的显微镜载玻片配置使用正置显微镜主要用于通过较厚的玻片的盖玻片,而不是使细胞可以成像。在某些情况下,尤其是当使用固体粘合剂,所安装的滑动可以打开,倒置显微镜上观察到无有害影响。另外,如果包含的校正衣领一个高分辨率的干物镜,试样通常可以被成像的物镜像差校正因子是通过底部的载玻片,如果能够以补偿额外的厚度(1毫米)。一个更灵活的配置,这是适用于直立和倒置显微镜,可通过在玻璃或塑料显微镜载片上钻一个1厘米的孔,安装盖玻片的一侧使用指甲油,硅酮密封胶,或其中一个的新的先进的粘合剂,可在硬件分销商(在图3e))。腔以及可与培养基或缓冲液填充和装配在上侧与第二盖玻片含有贴壁细胞,瞬时与VALAP安装。如果盖玻片小心地放置在一个完整的,很好地避免截留的气泡,光学透明的路径建立两者之间的盖玻片。否则,将被创建的弯月形的气泡,可以在透射照明模式下拍摄的图像失真。此配置优化使用正置显微镜。一种替代的加载技术,更适合于倒置显微镜,包括永久连接的盖玻片覆盖中所描述的细胞和生长培养基的第二盖玻片上生长的细胞。

 

各种各样的商业显微镜玻片培养室设计可满足许多短期的活细胞研究的要求。在这些范围内的复杂性,从简单的塑料培养瓶和稠合到玻璃显微镜载物片上的多井外壳复杂的集成系统,使灌注的操作,流的研究,多个相互隔离的文化的快速检测,3为图第3f)所示,通过(I)。所谓的实验室上的一个滑动装置系统是描绘在图3f)的多室设计,提供多种格式的,范围从一个单一的大腔室数(最多18)较小的腔室在一个单一的玻璃载片(图3f)的腔室中有4个矩形孔)。这些多才多艺,自足室都配有一个松散的塑料盖,使气体交换,但可以成为一个问题,由于半月板和双折射塑料成像时,传输模式。另外,通过腔室的设计限制启动,气体交换的量的时间,可以在外面的二氧化碳培养箱细胞不进行pH值升高的情况下,除非在滑盖内的环境控制腔成像。可以得到类似的腔室,是融合,以1毫米的玻璃显微镜载物片或170微米的盖玻片,这两者都用于可视化倒置显微镜下生长的细胞。的活细胞观察时段结束时,将细胞固定,染色,直接在生长室中,然后将其安装滑动或盖玻片除去。

 

3g)中示出的商用成像室结合细胞培养物的便利性,在培养皿中的光学质量的玻璃显微镜载片上,使用各种各样的对比度模式的高分辨率成像。观察信道连接的两个介质储层体积为100微升,5毫米宽,使一个大的细胞群的观察。流通过该信道可以被启动填充水库之一。由图3H)室岔通道精选可以购买专门的涂料涂层或处理模拟血管内皮细胞增长。在通道末端的鲁尔式适配器允许适应灌注系统精确调节流速和剪切应力。这种类型的培养室是针对特定研究赛场的定制设计的一个很好的例子。类似的腔室,图3中的(一)所示,设计为容纳非常小体积(10微升)中的干细胞分化的检测性能,分子识别与结合的研究,以及在基于荧光结合常数的测定成像。5个平行通道均配备一个单独的介质水库,以提高吞吐量。各种各样的专门室设计市售许多针对经济的材料和在具体调查的执行效率。

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培养皿中的各种配置专为高分辨率活细胞成像市售(见图4)。最简单的,也许是最多才多艺的设计包括一个标准的3550毫米的一次性培养皿中设有一个圆形开口(1014,或20毫米)切成附着表面的中心,高品质的硼硅盖玻片覆盖使观察的活细胞,在高分辨率(图4a))。腔室可无涂层或涂有薄薄的一层粘合促进剂如聚-D-赖氨酸或胶原。被称为玻璃底菜,这些成像室可在61224孔版本(图4C)),多培养实验。类似的设计(图4b)条)设有一个自定义的培养皿中,包含了大量的圆形盖玻片覆盖了整个修改后的菜基地。这些菜也可以在各种尺寸,可以购买有紧密装有盖子,以确保气氛,不像传统的培养皿中有气体交换的宽松盖。虽然标准聚苯乙烯培养皿中,可以采用常规的低分辨率观测(直接穿过塑料)具有较长的工作距离的物镜,具有校正铤,使用高数值孔径(1.21.4)耦合到油或水浸泡的物镜需要修改后的玻璃底的版本。

 

陪替氏培养皿培养室,在大多数情况下,比在图3中所示的显微镜滑动可以容纳较大体积的生长培养基中或成像缓冲器基本上充满了。介质量增加的危险降到最低温度或pH值的突然变化和长期培养,提供了优越的生长环境。这些腔室的另一个好处是,融合的陪替氏培养皿的底部,使盖玻片培养细胞后直接从孵化器中转移,而不是潜在的创伤诱导加载种子盖玻片或分离的细胞转变成一个专门的成像室高分辨率成像。在实践中,含有转染的哺乳动物细胞(表达荧光蛋白)的培养物可以被反复来回传输之间的加湿二氧化碳培养箱和显微镜载物台定期观察或记录很少或根本没有损坏细胞的图像。此外,越来越多的商业售后加热载物台和封闭显微镜孵化器旨在保持35毫米的玻璃培养皿底部长期时间推移成像序列。

 

3和图4(效果,显微镜载玻片和培养皿)中所示的简单的活细胞成像室可以经常洗涤,消毒,并在多个场合重复使用。第一步是要彻底清洁室用清洁剂,然后通过穷举用蒸馏水或去离子水漂洗,在无尘的容器中,在室温下干燥数天。更困难的情况下,特别是对那些已暴露于药物,干燥介质,或细胞粘附试剂的腔室和载玻片,单位可以预先用乙醇浸泡清洗或稀释的酸溶液,但这种治疗应避免与腔室,使用胶水或其它溶剂为基础的粘合剂,以确保一个脆弱的盖玻片,玻璃,金属,或塑料。清洗和干燥后,通过高压灭菌(不推荐)或治疗用紫外线灯在黑暗的机柜15分钟灭菌室。作为一种经济而快速的替代方案,许多简单的孵化室可消毒用乙醇洗涤,并在无菌的层流罩干燥。

 

可以观察到,虽然安装在载玻片上的细胞培养,或在玻璃底培养皿中生长瞬时显微镜舞台上几分钟,在室温下,各种商业设备已制造可以采用更长的时间,使这些简单的成像室期间的时间。被称为载物台载物台孵化器,所有这些单位提供本地化的温度调节(见图5),而更先进的设计,也使有限的气氛控制和遏制能力灌注。为标准尺寸的显微镜载物片(1×3英寸,请参阅图5a)和图5b))的保温板适合用于保持图3中所示的腔室的温度控制,并容易地适应大多数显微镜,通常用剪辑的原始载物台。图5中所示的滑动套(一)功能,完全包含在一个加热室之内的显微镜载片上的金属顶板。不幸的是,在打开的光圈,这是不加热的板盖玻片下观察试样区域所在。传热问题的玻片标本又因采用大光圈较小的观赏区,虽然经常会造成额外的问题阻碍体积较大的高数值孔径物镜的运动。在图5b)所示的加热的滑动保持器被设计为适应标准的倒置显微镜,并设有一个较小的光圈,以牺牲可用的观察区域提供更均匀的试样的温度控制。

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在最先进的显微镜载片上保暖多井室载玻片的孵化器在图5c)所示,其目的是提供一种高度可控的环境(图5f)中示出了一个类似的载玻片),调节pH值,温度,灌注的本地化的气氛。孵化器利用珀尔帖的技术,通过550摄氏度的温度范围内进行加热或冷却的试样,最多可容纳4个温度调节灌注线以及气体灌流。这个孵化器系统在众多独特的功能,是一个磁性底座,便于在显微镜配置和一个特别设计的抽吸去除灌流干扰最小液位。所描述的滑动套和孵化器在图5a)至5c)是连接到一个单独的控制单元,保持温度和其他必要的变量(如灌注和大气调节)的每个设备。

 

培养皿孵化器(见图5D5条(f))在设计和执行简单的显微镜载玻片载物台相似。最初级的版本,在图5d)所示,包括一个加热平台是容易地适应任何倒置显微镜载物台,可容纳高达10厘米直径的陪替氏培养皿。贴壁或悬浮细胞观察变暖板通过一个中心孔。即使不直接在上面居住光圈细胞加热板在较长的观察,可能会遇到的可行性问题,这道菜可以很容易地观看到光圈旋转移动相邻地区的文化。或者,较小的陪替氏培养皿(直径为3560毫米)可以更均匀地加热,并观察到使用这种温暖的。更先进的培养皿温暖的对角线位置的缝隙,而不是设计一个圆形的光圈是描绘在图5E)。这个孵化器可以不等,面积从60100毫米的培养皿中,一个较小的版本是35毫米的菜肴。的对角线狭缝跨越陪替氏培养皿的中心的周边区域,可以用来检查通过缓慢转动盘在观察期间,几乎整个培养。狭缝相邻的细胞维持在适当的温度,虽然与直接定位在开口部由于热梯度的波动。

 

6孔板载物台孵化器在图5中所示的(六)被设计为插入到倒置显微镜,并提供了充分控制的环境,使长期成像的一些文化。温度调节到10摄氏度的(这是连续监测,通过比较参考),通过循环水系统连接外部恒温控制洗澡室。一个单独的控制单元的混合物与空气中的二氧化碳,然后将其连续地输送到孵化器腔,而在腔室提供了一个蓄水池,以提供恒定的相对湿度。得到众多的配件,以容纳两个35毫米的培养皿中,多室玻片(图3f)),以及可更换的适配器装入1296多井板和单盖玻片室的腔室。这种先进的系统是非常有用的各种应用,从药品检测范围在广角和共聚焦显微镜观察荧光。

 

孤立的,未封闭的陪替氏培养皿和显微镜载物片,也可以保持在或接近生理温度下,用类似操作的方式类似的吹风机(如图6所示)或孵化加热器的热空气的设备。虽然温度的调节是有限的,以一个度的几十分之一,即使与比例控制器的应用程序和远程热传感器监控器,送风机的空气流直接到培养室和周边显微镜份(第一载物台物镜聚焦和聚光镜),提供快速响应的温度漂移。此外,施用药物和介质的变化是畅通的标本。不利的一面,开放的文化生长在培养皿中,并用热风机加热缓慢释放二氧化碳和水的pH值和渗透压逐渐漂移室。这一事实限制了使用鼓风机开放商会短期观测,可以在几个小时内进行。与此相反,封闭腔室系统(下面讨论),可以保持更长的时间内,利用鼓风机。空气吹风机的另一个缺点是,试样的温度不断变动(即使在一个窄的温度范围内进行),开启或关闭时,空气流,这可能会导致焦点漂移。培养条件可以增加整体的稳定性和漂移水平的降低环境柜周围显微镜耦合强制的热空气吹风机。红外灯也采用温暖的文化,但是它们也有从与鼓风机所遇到的类似问题。

 

如图5所示的加热装置大部分都限制领域观察活细胞(通常只有几毫米),需要特别注意,以确保有足够的净空物镜翻译舒适的光圈范围内。现代高数值孔径的油和水浸泡物镜是相当大的,有很短的工作距离,可能是这样笨重的碰撞与保温器,具有过厚的碱或太多上面的显微镜载物台安装。此外,翻译的跨培养室的玻璃表面上油物镜的能力可能会受到严重限制上存在许多暖载物台的小孔径。当选择一个载物台为活细胞成像温暖,研究者应光圈和物镜尺寸进行比较,以确保一个足够大的面积,可以观察到的培养室

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几个载玻片和陪替氏培养皿的保暖或孵化室上面所讨论的(图5)可任选配备有绝缘垫隔离加热平台从舞台,这一措施阻碍显微镜帧,通过热传导的金属部分的热损失。作为替代方案,这些加热板,塑料或复合材料制成的,以减少热损失的绝缘片上的薄的层(12毫米),可被安装。需要注意的是在显微镜载物台和帧是良好的热导体,并能迅速克服了典型的控制器,用来控制加热板的加热能力有限。通常的结果是一个渐进的温度下降(尤其是附近的光圈),这将影响细胞的活力和呈现的实验结果怀疑。另外重要的一点是必须考虑的,涉及到这些设备的实际性能。虽然在培养皿和载玻片暖通常具有优良的温度调节(十分之一的摄氏度),由于其比例控制器的准确性,根据观察试样区域的实际温度往往偏离设定温度,由于梯度创建跨光圈。出于这个原因,简单的载物台保暖耦合额外的加热装置,如物镜的加热器或封闭的环境的腔室,可能是必要的,以确保细胞生存力,在延长的成像会议。

 

几乎所有在本节讨论的简单成像室是不是在与环境的平衡,应仅限于非常短期的调查,通常范围从几分钟到一个小时最多。虽然专门的玻璃底培养皿中是有用的一些实验中,腔室从聚合物(实际上制造,标准的陪替氏培养皿和聚苯乙烯组织培养瓶)遭受不均匀的光学表面,表现出应变缺陷,禁止使用先进的成像技术,例如偏振光和微分干涉相衬。此外,厚室(塑料和玻璃),防止使用高数值孔径浸泡物镜。在采用简单的腔室的应用中也许是最不利的因素,但是,除了从低效的载物台式升温装置和成像室之间的热传递发生的是,伴随着缓慢蒸发介质的pH值和同渗容摩的逐步增加。总的来说,简单的培养室的许多缺点妨碍其有效申请严重的成像实验和研究人员应考虑下面的讨论更先进的替代品之一。

 

灌注

各种各样的培养室的设计,是市售的或可容易地在内部构造一般分为两个基本的功能的类别。第一,最基本的类,开放室系统,类似培养皿定制载玻片如上所述,在使用过程中慢慢接近平衡与周围的气氛。更复杂的封闭的腔室是密封的保护细胞从培养基中的蒸发,以确保环境变量,如pH值,二氧化碳浓度和渗透压,保持原状。一个开放的腔室的细胞培养系统中生长的细胞将允许容易访问,从而容易地使显微注射,膜片钳,除了药物及其代谢产物的培养基中,细胞和其他必需的操作变化。与此相反,封闭的腔室提供来自外部环境的绝缘性能优越,但呈现访问困难得多的细胞。最封闭的室内设计包括端口允许添加新鲜培养基和药物在实验过程中不中断的成像序列。在这些系统中,是受一个蠕动泵,一个马达驱动的注射器,或通过重力控制歧管灌注。新的解决方案加入到一个封闭的腔室系统,应先平衡成像室相同的温度和大气条件。此外,许多细胞系中,对剪切敏感的,因此必须要在非常低的流速灌流连接到盖玻片的贴壁细胞。下面描述的更高级的封闭腔系统设计,提供严密的控制剪切力。

使用开放或闭合的培养小室系统之间的选择通常取决于由特性的调查,包括必要的时间和空间分辨率,以及持续时间。高分辨率明场成像技术依赖于DICHMC,或相衬需要聚光镜的数值孔径等于或大于物镜。因此,要实现全分辨率1.4数值孔径与60倍的物镜,必须等于数值孔径匹配的聚光镜。一个高分辨率聚光镜科勒照明下运行的最大工作距离,因为只有几个毫米(这取决于聚光镜的工作距离),这个因素限制在观察室的物理尺寸。小于封闭小室系统能够只包含有限的体积的培养基中(通常大约几百微升),这可能会成为一个问题。长期培养,如果未采用灌注系统。

 

与此相反,不需要伴随高分辨率的荧光调查传输光技术往往与开放的腔室来完成,缓和改变介质或进行其他操作(如电生理测量)向培养的任务。封闭的腔室也需要特别注意的培养基中的缓冲能力,pH值不能被控制的典型的碳酸氢钠/二氧化碳系统。作为替代方案,可以利用或气体没有被缓冲的介质,应考虑合成缓冲液补充品(如HEPES)。在任何灌注室中,灌流液,盖玻片视窗,液浸介质的折射率之间的差异可以引入显着误差信号的衰减深度测量结果。许多这些工件可以减轻与水浸泡物镜,但图像质量仍然是优异的情况下,将细胞附着到盖玻片。

 

如图7所示的几个商业灌注室设计活细胞成像实验,在不同的光学分辨率。在图7a)所示的结构是一个自包含的环境室,里面的皮氏培养皿随着灌注,温度和湿度控制,以及大气中的气体组合物的调节能力。图7b)示出了钻石形的灌注室(下面将讨论),在加热载物台的适配器,而图7c)示出了类似的设计,但是有一个圆形的腔室。各种流室载物台插入图7中的适配器(b)和7c)使调查微调的细节成像实验生理学和细胞生物学。能够被固定在一个机架,卢丁式的灌注室(d)为图7所示的用于成像的多个样品与灌注在一次实验中有用。虽然没有被加热腔室本身,它可以被安置在加热的台板,或连同一个物镜的加热器或全封闭环境室中使用。在图7(五)的Petri式的灌注腔模制包含灌注流体的引进和排气端口,但不包含温度控制元件。同样,在图7的腔室(六)包含多个端口,和被设计为插入到标准的6孔培养板,包含塑料生长表面上的贴壁细胞。在图7中(克)加热灌注室被设计为可安装在显微镜载物台上,用一个圆孔径,并围绕中心井的周边设置有多个端口。需要注意的是数以百计的活细胞灌注室市售,所以鼓励研究者扫描商会针对特定应用的可用性之前提交到一个单一的设计。

 

灌注室设计的重要考虑因素是机械连接(如有必要)和稳定的检体,流体机械的流动特性和交换腔室的时间,以及光的工作距离和折射率浸油,文化的解决方案,通过观察将发生的玻璃板。活细胞成像封闭或开放室的标本可以被固定的自然坚持盖玻片,附着力促进剂(例如,聚-L-赖氨酸和胶原),或在薄薄的琼脂覆盖第一嵌入。调查的要求,决定必须在灌注室可供观察的玻璃表面面积的大小。随机的细胞群往往可以使用相对较小的盖玻片,但更大的区域非常大的细胞或网络可能是必要的,在特定的事件(例如,有丝分裂)的情况下,必须筛选许多细胞。

 

无论在盖玻片表面积,形成检体腔(理想的情况下,厚度170微米)的薄玻璃板应该是无应变,光学平面,并在一个平行的方向定位。需要注意的是更大的可视区域更容易泄漏和物理损坏,但提供显着更多的机会获得高数值孔径物镜,往往万桶不等,直径从3厘米至5厘米(更笨重安装加热器)。分庭应利用组件是没有毒性的活细胞。现代市售的培养室中的构造由玻璃,不锈钢,高强度合成聚合物,聚四氟乙烯,和硅树脂,通常使用粘合剂,在最终组装。这些材料可能含有有毒重金属或有机溶剂,应删除之前进行彻底清洗消毒和使用的痕迹。

 

灌注腔室通常是必要的,以确保细胞培养物的可行性调查时,需要冗长的成像序列,或者如果串行此外,代谢物,示踪物,和/或药物不干扰视场的情况下,必须完成。此外,灌注腔室使研究者周期性地采样蜂窝产品的生产培养基中,并进行相关的研究,在该标本中的生存状态监视在一段时间内,其次是在观察过程中突然固定重建结构或细胞学事件相关过程中的利益。灌注的主要优点是有能力保持在长期实验中的介质的pH和离子浓度,以及不破坏细胞的情况下,得到一种机制来引入各种试剂(注入腔室)。例如,灌注使研究者不中断图像采集过程中的时间推移序列引入到培养的药物。

 

灌注室之间的最重要的特征是,整体的设计必须采用的层流特性,这样的解决方案,通过以相对较少的混合,可以迅速和有效地交换。对于一些调查,层流可能不是至关重要的,但更严谨的研究往往要求高度控制的介质交流,尤其是当其他代理商正在增加。灌注室的流体机械的性能密切相关的几何形状(如图8所示)。层流时,会发生该室的横截面是非常相似的,甚至是相同的,该入口管。最不利的流动模式时,会出现比较大的入口管室。图8比较在几个流行灌注室的流动模式。图8a)中示出的圆形的腔室,有交流特性较差,由于介质的突然扩张,从进液管的开口,这会导致在二次流和非均匀简化。逐步扩展,所描述的图8b)和图8c),结果更加均匀简化和快速交换。在图8中所示的锥形区的入口和出口管的腔室的设计(二)改善流动剖面,而更均匀的流动通过容器中的钻石形的几何形状的腔室(三)在图8中的结果。图图8d)中提出的微渡槽室具有优越的层流特性由于蚀刻的通道,引导整个试样轻轻介质

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正如上面所讨论的,它往往是必要开发一种可靠的方法直接灌注细胞成像室不妨碍实验收购电力,化工,光学数据。灌注室中的流体流过发生了新的流体传递到进气口,而这又迫使使用了通过的排气口上的流体的交换。因为大多数活细胞成像室包含相对微量的组织培养基中,在灌注过程中的剪应力的敏感性,细胞,以及孔处(通常被称为为膜片的效果),必须创建盖玻片的振动的潜力选择时要考虑抽水系统。在许多情况下,这个选择的过程中,与大多数其他因素在活细胞成像,涉及一个或更多的妥协。理想的灌注泵将提供一个严密控制的,纯模拟的流介质无限期的,但这种类型的系统还有待开发。

 

灌注流体通过交付的标准技术是重力流,自动或手动注入用注射器(参见图9b)),与机械泵。重力流是安装简单,价格相对低廉,但通常所必需的显微镜上面的流速难以控制。在最基本的配置中,重力自流进料系统需要一个大的介质储层的位置放置在高处与连接到成像室的无菌管的截面的显微镜。的流量调整由针形阀控制的排气管连接到腔室的相对侧,成收集盆下水道。另外,汇率灌注在重力系统可以控制通过改变两个水库之间的垂直距离或一旋塞的控制流从上水库。重力进料系统的层流特性往往是不足的,但就足够的情况下的主要要求是能够快速交换培养基中。

 

对于依赖于精确的药物或其他化学品,以及优于纯粹的力控制在盖玻片的表面上(如细胞附着)另外的实验中,一个更复杂的灌注装置是必要的。流体交换率,它可以是非常关键的专门的实验中,增加了改进腔室的几何形状。在灌注室半的时间少于50毫秒的流体交换已经实现而不扰乱试样卧位或轴向焦平面。甲步骤的浓度变化可在少于100毫秒的时间来实现,用相对低的线性流速,其中两个灌注液的交界处的位置靠近的腔室,腔室,设置有一个小的内部体积,并保持层流配置文件。许多市售满足这些条件的先进灌注室。

 

定期加入生长因子,抑制剂,药物,和其他代谢物在灌注过程中,可以很容易地通过使用手动注射器。机械泵,蠕动(图9a)和图9b))或电动注射器(图9E))的设计,是最可靠的设备提供的灌流液。长期实验的音量和送货上微升流尺度的变化(由于临时粘在柱塞)的注射器泵是有限的。采用步进电机的泵可以被控制,以很慢的流速,但在液力脉冲可以制作盖玻片弯曲或撞出细胞的瞬时的转子运动的结果。先进的灌注泵配有调节耦合到一个降压的传输驱动配备的辊子主轴速度控制的直流电动机。其结果是,是免费的,便宜的蠕动泵的典型的突然脉动的流动剖面。在选择灌注送货系统,研究者应当考虑所需的流速,流过不同时间尺度的均匀性,以及传递的总体积,以及质量流量。

 

此外,以确保合适的灌注腔室的流体的流动特性,进纸器的解决方案可能还需要注意的温度和气体组成。如果二氧化碳和碳酸氢盐缓冲系统,所有的灌注液应保持平衡的适当的二氧化碳分压(碳酸氢盐的浓度依赖于),并保持在相同的温度下培养室。因此,灌注液必须毒气,它们引入灌注室之前调整它们的温度。请注意,减少二氧化碳的溶解度随着温度的增加,因此必须加以调整,上面的腔室的温度设定值或气体混合物的温度差,必须将毒气的解决方案。各种商业设备提供用于保持灌注液的温度和气体组成。另外,合适的设备可以很容易地在内部构造使用常见的实验室组件。介质瓶,管,和一个鱼缸空气石(图9c)条),同时可以制作简单的湿度试验箱的温度可以控制循环水洗澡或桌面孵化。更复杂的单元(图9d)图中所示)的设计,同时调节pH和湿度。介质的静态的解决方案,因为有一种倾向,冷却和失去二氧化碳(其后产生的pH值增加)时,所有的解决方案应该被连接到使用不透气的管材通过加热的水浴或培养箱灌注室。

 

活细胞灌流实验管接头的选择应只限于那些产品(最好是带有一个USP VI级认证),表现出最大程度的生物相容性,从而保证了成像会议期间油管源性毒性缺乏。目前,有三个品种,以满足这一要求:PHARMED(可通过众多分销商),聚乙烯2275C-Flex的商业油管。即使它是非常适合用于细胞培养,PHARMED管的主要缺点是低的不透明度,从而降低了通过油管旅客灌流液的可见性。其结果是,可能形成的气泡作为灌流液通过油管很难检测到。相比之下,C-Flex和聚乙烯管几乎是透明的,不容易进灌流浸出增塑剂。后者的产品是大多数灌流实验的理想场所。

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灌注腔室中使用的一个潜在问题是,试样往往反弹的重点盖玻片弯曲迫使流体通过腔室的过程中,则初始化或终止时,在有限的程度,如前面所讨论的(隔膜效应)。此神器室灌注系统控制​​不佳是显而易见的。盖玻片挠曲可能不存在显着的问题,在灌注会话之间的图像捕获序列的情况下,可以是交错的,但它可能会严重影响这些研究的需要相对高时间分辨率(2秒或更少)。盖玻片弯曲的严重程度可以最小化通过减少输入端口(和油管成色剂)的直径的排气口的静水压力,使流体的流动过程中不累积。此外,代以重力流系统的蠕动泵,可以减少或消除振动板的效果。

 

在所有灌注室使用的一个主要问题是形成气泡(由于泄漏,表面张力,脱气),这可能会干扰与层流的培养基中,以及在成像过程中降低对比度和锐度。一个正确配置的灌注室应形成一个封闭的系统,应消除后的试片被安装在显微镜上的和隐藏的空气在腔室或管路口的或潜在的泄漏,但在启动之前的实验。在重力系统,最简单的方法来清除气泡是填补了水库和室,停止流过系统,然后再慢慢清除活塞,同时检查所有组件。用泵系统通常更难以纠正,并应特别注意支付的微小气泡,可能隐藏在腔体外壳之间的盖玻片和灌注口。在所有的情况下,整个系统应完全封闭的,并装有流体到第一灌注前,以尽量减少的盖玻片弯曲灌注启动和终止。确保排气管沉浸在catch盆地悄悄溜回到室,以避免气泡。

 

对于许多调查,灌注腔室的输入口和排气口的定位必须不干扰的变化的显微镜物镜。大多数夹心式腔室的设计,使端口被定位在相同或相对的腔的边缘,通常可以将其用于与直立和倒置显微镜。然而,腔室,具有安装在壳体的上部分上的端口可能会阻碍正置显微镜的物镜转盘上的运动。许多现代商业灌注腔(见图1和图7),旨在使显微镜炮塔旋转而不阻塞,但这一因素应该先进行测试,然后决定在一个特定的腔。此外,塑料灌注和嵌入在大型金属舞台上的适配器倒置显微镜成像室,可能无法提供足够的间隙物镜旋转不首先降低的物镜离室。

 

虽然绝大多数的活细胞成像的调查,需要维持在高于环境温度升高的文化,一些研究涉及的生物体观测,必须在非常低的温度下生长的,而另一些研究在试样上的突然冷却的影响。对于长期的实验,最好设在显微镜在寒冷的房间,以避免在室温下的冷表面上形成冷凝水的问题。在寒冷的房间的情况下,用于冷却的应用程序设计的灌注腔室是市售的。这些设备往往依赖于前螺旋线或油管,以减少温度的冷冻乙醇溶液的流动。专门的物镜聚光镜冷却器可能是必要的,以避免这些显微镜元素的试样加热,可以防止由外部涂层的玻璃表面,用化学相似的图像流(柯达)结霜。无论调查对温度的要求,然而,应注意的是,保持一个确切的温度​​值,通常是一样保持稳定的实现和稳定地保持一个恒定的温度并不重要,重要。

 

高级封闭与开放系统成像

在一般情况下,倒置显微镜(组织培养)是最常见的活细胞成像仪器,但正置显微镜也适合用于此目的,有几个重要的让步。研究者必须谨慎设计实验(无论在显微镜帧配置)确定必要的倍率范围,工作距离的限制,和最佳的数值孔径,所有这些都涉及到景深。流体耦合的物镜(油和水浸泡)在大多数情况下,将可使用的温度控制时,利用与哺乳动物细胞培养。在透射光中的应用程序需要高数值孔径的聚光镜中,腔室必须能够容纳的工作距离,物理尺寸,靠近聚光镜的前透镜元件,特别是在油的上部腔室玻璃。显微镜载物台的几何形状也应与培养室的尺寸相匹配,以确保有足够的间隙。一般来说,倒置显微镜是由于较长的工作距离聚光镜和使用这些工具的能力高数值孔径物镜光学表面上直接支持细胞活细胞调查优越。

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采用先进的开放室培养系统时,应考虑一些变量。特别是,体积,孔径尺寸,建材,盖玻片厚度,腔室的几何形状和生物相容性问题必须解决。其他因素可能会影响实验的成功,包括蒸发(冷凝),环境光线,视角,和实验室的环境条件。对于更复杂的封闭系统室,许多同样的考虑也适用,但是,额外的特性也很重要。其中有固定的或可变的腔室容积的要求,光学表面,流体交换率,层流,剪切应力,灌注流量梯度,流道的几何形状之间的间隔距离。此外,温度控制和均匀性和热效应的油或水的浸入物镜是两个系统设计的重要因素。

 

封闭系统的活细胞成像室需要的情况下,那里的文化,必须从外部环境完全隔离,或应用程序中使用先进的对比度增强技术,传输光学显微镜(如高分辨率DIC)。在这些情况下,细胞被放置在一个温度控制,灌注的光学谐振腔,或直接生长在盖玻片形成室下部光窗口。各种各样的传统和先进的设计,配置,售后为封闭系统成像室市售。绝大多数的这些设计利用两个光学表面分离的密封垫片,被钳位在一个金属的或聚合的壳体一起形成夹心灌注环提供的相似的特征。其中发现许多密闭的腔系统的缺点是过度光学表面之间的分离,固定光学腔容积,冗长的流体汇率,动荡的灌注,在装载困难,和泄漏。一些更先进的开放和封闭系统成像室设计,以解决共同的问题,并提供出色的成像特性如下所述。

 

Bioptechs三角洲T开放系统

三角洲T Bioptechs 培养室系统提供了一些创新的设计图案,可以利用一个令人惊讶的优势,广泛的静态和灌注活细胞成像实验。仿照传统的开放室培养皿后,三角洲T培养室由一个35毫米的菜融合到一个170微米的盖玻片跨越整个底部采用了表面的热转印技术,以保持温度控制(如图10所示)。热控制策略是基于后,铟-锡氧化物(ITO),施加到盖玻片的下表面的透明导电层的薄膜涂层。相反的盖玻片边缘沉积导电接触,搞了一系列电极菜是正确就位时,在专业舞台适配器。温度的调节,通过热敏电阻器的反馈回路(容纳在一个外部控制器单元),它适用于涂覆底面盖玻片电流,从而整个烹调加热到所需的温度。使用这种技术的热响应是每秒约0.1摄氏度。

德尔塔T系统的快速响应时间,使控制器切换电流的流动,在几秒钟内打开和关闭,从而有可能以补偿温度变化,发生由于表面蒸发,熵,或灌注中的菜。耦合到快速的响应时间是一个高速的安全电路设计控制器错误事件中保护细胞。该系统提供了高分辨率的成像能力通过无应变均匀的玻璃表面,并可以用护罩玻璃的各种厚度,包括数字1.5的高数值孔径的应用程序设计的盖玻片。这道菜环境兼容流行的对比增强模式,明,暗场,偏光,相衬,DICHMC,荧光,多光子共聚焦显微镜。

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1993年引入,使用盖玻片上的薄膜涂层的第一表面的热传递技术提供了广泛的修改和变化的基本原理的基础。例如,德尔塔T和类似的系统是有用的,在调查过程中温度的控制,可以从物镜在适当的焦距的光学参考平面悬浮在组织切片标本。此外,适配器可以很容易地安装,长时间保持低容积灌注。紧密配合盖也可利用高数值孔径实验标本介质或成像缓冲区完全充满以上定义一个光学表面的温差计算菜肴。此装置消除空气和介质的表面之间的界面,从而防止图像对比度的变化,结果在介质上的物镜卷,从微小的波动。此外,可用于低倍率的传输或高倍率荧光实验的电加热的,光学透明盖玻璃盖。盖罩玻璃的热控制,可以防止冷凝的下表面上形成。此外,另外的气体端口可以被用于保持在培养气氛中的二氧化碳的浓度在长时间的加热盖。可以通过潜入菜盘管循环的制冷剂液体冷却标本三角洲T系统。

 

Bioptechs FCS-2闭环系统

介绍一个的独特的微渡槽控制灌注技术,Bioptechs关闭系统FCS-2培养室,是一种先进的解决方案,许多的困难,经常遇到的剪切应力和在灌注室中的流动几何。在这个系统中,微渡槽观察室制作成一个定义的表面的光学谐振腔(参见图图1b),图8d),图11b)),将灌注槽。这种设计消除共同的许多其他腔室通过创建只有一个单一的分离灌注从盖玻片滑动垫片的光学腔灌注环。的物理配置的微渡槽槽产生优秀的层流区域的光学谐振腔中,而的单密封垫设计使研究者定义的尺寸,体积,厚度,及形状的腔室。此外,微渡槽灌注室提供大光圈流,输入和输出,从而减少体积交换率的问题。为了进一步提高性能的FCS-2室系统的第一表面的热传递技术(如上所述)施加的玻璃微渡槽,热均匀性,从而增加腔室,即使在没有流动的期间。因此,细胞培养物保持在一个温度控制的光学光学显微镜的所有模式兼容的环境安全。

 

东海希多孵化载物台

行销下的各种商号及配置,东海希多载物台顶部孵化器(型号INU)是由几个主要的显微镜制造商,无论是作为一个的灌注设备或作为静态室的组合系统,可以利用模拟条件在湿润的二氧化碳培养箱中(图11a)中示出)。高湿度均维持通过一个圆形,恒温水槽配备二氧化碳注射器喂食由远程气体混合单元。聚光镜光圈护罩玻璃加热由第一表面上的涂层,以防止结露的形成,同时使透射光微分干涉对比和偏振光成像技术在低数值孔径的应用。在盖玻璃上的接入端口允许图像采集会话过程中的代谢物和药物注射。腔室的设计与的灌注配件和一种抗漂移板的上方插入到隔离培养皿中,从加热元件的加热载物台,从而最大限度地减少焦点偏移。一个可选的物镜加热器可用于与浸没物镜维持样品温度。室的设计和多种气体混合是最流行的商业显微镜。

 

最全面的商业包装成像室是由华纳仪器,专家,电生理和细胞生物学研究工具。该公司提供了惊人的阵列成像和录音室,载物台适配器(参见图7c)),温度控制器,灌注系统,物镜暖,漏油传感器,专为广泛的应用在灌注加热器。此外,由于活细胞成像技术在细胞生物学实验室成为一种比较流行的,越来越多的创新培养室结构,打算灌注和静态文化,将不断推出由厂家售后。活细胞成像的特定商业培养室系统之前,研究者应仔细细读丰富的上线和发表的科学文献。