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奥林巴斯显微镜:荧光的基本概念

2013-10-16  发布者:admin 

荧光是敏感,其中创建的物理(例如,光的吸收),机械(摩擦),或化学机制从电子激发态的分子发光的无处不在的发光过程家族的成员。通过由紫外线或可见光的光子的分子的激发发光发电的是这样一种现象称为光致发光,正式分为两大类,荧光磷光,这取决于激发态的电子组态和排放路径。荧光是一些原子和分子的属性,在一个特定的波长吸收光,并随后经过短暂的时间间隔更长的波长的光发射被称为荧光寿命。发生的方法的磷光荧光的方式类似,但是具有更长的激发态寿命。

fluorescenceintro figure1

荧光的过程是由三个重要的活动,所有这些由几个数量级的(见表1),分离的时间尺度上发生。激发的易感分子由一个传入的光子发生在飞秒(10E-15秒),而最低能量级别的激发态电子振动弛豫是慢得多,并且可以测量在皮秒(10E-12秒)。最终的过程中,发射的较长波长的光子,并返回到基态的分子,纳秒(10E-9秒),在相对长的时间内发生。虽然整个分子的荧光寿命,激发排放,仅在十亿分之一秒,这种现象是一个惊人的表现,光与物质之间的相互作用形成的基础,广阔的领域的稳态和时间分辨荧光光谱仪和显微镜。由于极大地敏感排放概况,空间分辨率和高特异性的荧光调查,该技术正迅速成为遗传学和细胞生物学的重要工具。

一些调查报告在十七和十八世纪的发光现象,但它是英国科学家乔治爵士G.斯托克斯荧光谁首先介绍于1852年,是负责铸造项荣誉的蓝白色荧光的矿物荧光(氟石)。斯托克斯还发现发射光谱的波长漂移到更大的值,他的名字命名。在二十世纪早期的一部分,由几个著名的科学家,其中包括8月克勒和卡尔·赖克特,最初报道的荧光是一个讨厌鬼,在紫外线显微镜的光学显微镜荧光第一次遇到。第一荧光显微镜由德国物理学家奥托·Heimstädt和海因里希·莱曼在1911年和1913年之间,作为一个分拆上市的紫外线仪器。这些显微镜观察到细菌,动物和植物组织的自体荧光。此后不久,斯坦尼斯拉夫·冯·Provazek推出了一个新的时代,当他用荧光显微镜来研究固定的组织和活细胞中的染料结合。然而,直到20世纪40年代初,阿尔贝浣熊开发出一种技术,用荧光染料标记抗体,从而造就了免疫领域的。到二十一世纪之交的,本场荧光显微镜在细胞生物学中的一场革命,负责特定的多个标签的单个细胞器和大分子复合物合成和基因编码的荧光探针耦合的力量,活细胞成像。

荧光过程的时间尺度范围内

过渡

过程

速率常数

时间刻度(秒)

S(0)=> S(1)或S(n)

吸收(激发)

瞬间

10 -15

S(n)=> S(1)

内部转换

K(IC)

10 -14到10 -10

S(1)= S(1)

振动弛豫

K(VR)

10 -12到10 -10

S(1)= S(0)

荧光

K(F)或Γ

10 -9至10 -7

S(1)=> T(1)

系统间的隧道

K(PT)

10 -10至10 -8

S(1)= S(0)

非辐射
弛豫猝灭的

K(NR),K(Q)

10 -7至10 -5

T(1)= S(0)

磷光

K(P)

10 -3至100

T(1)= S(0)

非辐射
弛豫猝灭的

K(NR),K(QT)

10 -3至100

表1

荧光一般是与高度共轭的多环芳香族存在在几个能量水平在地面状态下,每一个与一个特定的安排的电子的分子轨道中任一项的分子研究。一个分子的负电荷的分布和整体分子的几何形状确定的电子状态。对于任何特定的分子中,存在几个不同的电子态(在图1中示出为S(O) S(1) S(2) ),根据总的电子能量和各种电子自旋态的对称性。的每一个电子的状态被进一步细分成若干与原子核和成键轨道的振动和转动能级。对于大多数有机分子的基态电子单中的所有电子的自旋配对(有相反的旋转)。在室温下,极少数分子存在于任何其他国家比基态的最低振动能级,从而有足够的内部能量,激发过程通常来自这个能量水平。

类分子能够发生电子跃迁,最终结果是已知的作为荧光探针荧光染料,或仅仅染料荧光。荧光染料的共轭到一个更大的大分子(如核酸,脂质,酶,或蛋白质),通过吸附或共价键被称为荧光团。在一般情况下,荧光团被分成两大类,称为内在的外在的。内在的荧光基团,如芳族氨基酸,神经传递素,卟啉,和绿色荧光蛋白,是那些自然发生。外源性荧光基团是人工合成的染料或修改的生化物质被添加到一个样本具有特定的光谱特性产生荧光。

吸收,激励和排放

发生在不同的分子轨道激发态之间的间隔紧密的振动和转动能级的荧光染料吸收的能量。有古典的雅布隆斯基能量图(见图1),命名荣誉的波兰物理学教授亚历山大·雅布隆斯基的各种能量水平参与的吸收和发射光的荧光。一个典型的雅布隆斯基图示出的单峰接地(S(0) )的状态,以及第一(S(1) )和第二(S(2) )的激发单重态的水平线作 ​​为堆栈。在图1中,较厚的线表示电子的能量水平,而较薄的线表示的各种振动的能量状态(旋转能量状态将被忽略)。作为直链或波浪形箭头所示状态之间的转换,取决于是否吸收或发射的光子(直箭头)或查询结果,从分子的内部转换或非辐射弛豫过程(波状箭头)与过渡。垂直向上箭头用来表示的瞬时性激发过程,同时保留更长的时间尺度上发生的这些事件的波浪形箭头。

吸收的光的发生非常迅速(约飞秒,所必需的时间为旅行单一波长的光子)在离散量称为量子和对应于从基态跃迁至激发态的荧光激发。同样地,通过荧光或磷光发射的光子在量子方面也被测量。量子中的能量(普朗克法)由以下方程表示:

E =hν =HC /λ

其中 ,E 是能量,h是普朗克常数,νλ是入射光子的频率和波长的,  c 是光的速度。普朗克定律决定的吸收的光子的辐射能量成正比的频率和波长成反比,即入射的波长较短具有更大的量子能量。的吸收一个光子的能量,它的发生是由于振荡与分子中的电荷(电子)的光波的电场矢量的相互作用,由荧光团是一个全或无的现象,并且可以只发生与入射光特定波长的吸收带。如果被吸收的光子包含更多的能量比为一个简单的电子跃迁是必要的,多余的能量通常被转换成振动和转动能量。然而,如果之间碰撞发生的分子和一个光子具有足够的能量,以促进过渡,不发生吸收。谱宽的吸收带产生紧密间隔的振动能量水平加上热运动,使一个范围的光子能量,以符合特定的过渡。由于激发的分子通过吸收通常发生在电子自旋配对而不改变,激发态也是一个单峰。在一般情况下,荧光调查工作是在辐射具有波长范围从紫外到的电磁波谱的可见光区域(250〜700纳米)。

使用紫外线或可见光,常见的荧光团通常是兴奋较高振动能级(S(1) )的第一或第二(S(2) )的单峰的能量状态。之一的吸收(或激励)的转换示于图1(左手绿色箭头)的发生,从最低的基态的振动能级更高的振动水平的第二激发态(过渡记为S(O) = 0〜S(2) = 3)。第二激励过渡描绘从第二级的振动的基态的第一激发态的最高的振动水平(表示为S(0) = 1 S(1)= 5)。在一个典型的荧光基团,具有宽的光谱的波长的照射会产生允许的跃迁,填充的各种振动的激发态的能级的整个范围。一些这些过渡将具有高得多的程度的概率比其他人,并相结合时,将构成该分子的吸收光谱。请注意,对于大多数荧光,吸收光谱和激发光谱是不同的,但往往重叠,有时可能会变得难以区分。在其他情况下(例如荧光素,)的吸收光谱和激发光谱清楚地隔开。

fluorescenceintro figure2

紧随吸收一个光子,几个进程将发生的不同的概率,但最有可能将是最低的振动能量的第一激发态(S(1)= 0,图1)的水平的放宽。这个过程被称为作为内部转换振动弛豫(光发射的情况下的能量损失),一般发生在一皮秒或更少。因为蒸发过程中激发态的寿命显着的振动周期,分子几乎总是进行完整的振动弛豫在他们兴奋的寿命。过量的振动能量被转换成热量,该热量被吸收由相邻的溶剂分子碰撞的激发态的荧光团时。

期间纳秒(时间最长的时期,在荧光过程由几个数量级)的顺序,最后才放宽到基态的激发态分子中存在的最低激发单重态(S(1) )。如果从这个长期存在的状态是伴随着放松发射一个光子,这个过程是正式称为荧光。紧密排列的振动能级的基态,再加上正常的热运动时,在发射的光子能量,产生广泛。其结果,通常观察到荧光发光强度以上的频带的波长,而不是一个清晰的线。大多数荧光基团可以成千上万次重复的激发和发射周期数以百计的高反应性的激发态的分子是光致漂白之前,导致销毁荧光。例如,充分研究的探针的荧光素异硫氰酸酯(FITC)可以为约30,000个周期前的分子不再响应入射照明光进行激发和放松。

其他几个弛豫途径有不同程度的概率与荧光发射过程竞争。非辐射激发态能量可以消散热量(由青色波状图1中箭头所示),激发荧光团可以与另一分子碰撞,来传递能量的非辐射过程中的第二类型(例如,猝灭,如所指示的紫色波浪箭头在图1中),或者被称为系统间跨越的最低激发三重态能发生(在图1中的蓝色的波浪形箭头)的现象。后一种情况是比较少见的,但最终的结果无论是在发射的光子通过磷光或产生延迟荧光的激发单重态的过渡。禁止来自三重激发状态的转换到单线基态,这会导致在三重态发光的几个数量级低于用于荧光的速率常数。

三重态跃迁图解雅布隆斯基能量轮廓上的右手侧在图1中示出。间窜越低概率发生的事实,分子必须先经过旋转转换未成对电子,不利的过程。三重态的基本重要性是所表现出分子在该状态下,其结果往往是在漂白和生产造成的损害的自由基的化学反应性的高度。在生物样本中,溶解的氧是一种非常有效的在三重态的荧光的猝灭剂。这通常是一个三重的基态氧分子,可以激发单重态反应,导致的反应,漂白剂,荧光或具有活细胞光毒性影响。三重态的荧光基团中也可以直接与其它生物分子的反应,通常在这两个物种的失活所导致。分子中含有重原子,如卤素和许多过渡金属,通常方便系间窜越经常磷光。

从基态(S(0) )发生的激发单重态(S(1) )的过渡的概率取决于一个电子时,驻留在与那些的接地状态对之间的相似程度的振动和转动的能量状态目前处于兴奋状态,图2中列出的。图2中示出的Franck-Condon能量图呈现的振动能量的概率分布之间的各级在地面(S(0) )和第一激发 S (1) )指出针对一种假设的分子。激发从地面到激发态的跃迁(红色线)发生在这样一个短的时间内(飞秒)的核间的距离与成键轨道不具有足够的时间来改变,从而转换被表示为垂直线。这个概念被称为“ 弗兰克-康登原理。的最大吸收波长(红色线在中心)表示的最可能的核间距在基态到允许的振动能级处于兴奋状态。

fluorescenceintro figure3

在室温下,是不足够的热能,显着填充兴奋的能量状态和最有可能的电子状态是基态(S(O) ),其中包含了一些不同的振动能量状态,每个不同的能量水平。最被看好的过渡将是那些最大限度的转动和振动的电子密度概率重叠的基态和激发态(见图2)。然而,不同波长(与量子)的入射的光子可以具有足够的能量,以被吸收,并常常产生来自其他核间的分离距离和振动能级转换。这种效应引起到包含多个峰(图3)的吸收光谱。广泛的光子能量与吸收转换荧光基团,使产生的光谱显示为宽波段,而不是离散线。

假设的在图3中示出的吸收光谱(蓝波段)的查询结果从几个偏爱的电子从基态跃迁至激发的最低能量状态(标记为S(O) S(1) ,分别)。的吸收光谱是叠加在垂直线(黄色)代表从在基态的最低振动能级转换到较高的振动能级处于兴奋状态。需要注意的是过渡到最高的振动激发水平是那些发生在较高的光子能量(低级波长或更高的波数)。沿着上图3的横轴表示在电子伏特(eV)与转换相关的近似能量。还包括与态和激发态的振动能级沿右侧纵坐标。

通过荧光团的吸收光谱的扫描,同时记录在一个单一的波长(通常为最大发射光强度的波长)的发光强度,将产生的激发光谱。同样,令人兴奋的在单一波长(再次,优选的最大吸收波长)的荧光团,而通过扫描的发射波长将揭示的发光光谱的更新。可被视为概率分布函数给定的量子能量的光子将被吸收,并最终使荧光团发射的荧光辐射的形式的第二光子激发和发射光谱。

Stokes位移和镜像规则

如果仔细审核的荧光团的荧光发射光谱,几个重要的特点变得显而易见。作为快速的内部转换的结果,从较高的初始的S(1)激发态的最低振动能级的激发态的激发能量(波长)的发光光谱是独立的。对于许多常见的荧光基团的振动能级间距是相似的基态和激发态,从而导致的荧光光谱的吸收光谱,外观极像的镜像。这是由于这样的事实,相同的转换是最有利的吸收和发射。最后,在溶液中(如荧光团一般研究)的详细的振动结构一般是丢失,显示为一个宽峰的发射光谱。

如前所述,光子吸收后,激发荧光团将迅速进行松弛到最低的振动能量的激发态。这种快速的内部转换的一个重要后果是,所有后续的继续从最低级的振动激发态(S(1) )的的放松途径(荧光,无辐射弛豫,间窜跃等)。具有吸收,激发态的电子在将返回一个特定的振动的能量水平在地面状态的概率是正比于在各自的状态(图2)之间的能量水平的重叠。返回到基态(S(O) ),通常会出现更高的振动水平(参见图3),其后达到热平衡(振动弛豫)的过渡。因为发射一个光子经常离开更高的振动的基态中的荧光基团,发射光谱是典型的吸收光谱得到的从地面到第一激发态的过渡的镜像图像。效果,返回到一个特定的在地面状态的振动能级的电子的概率是类似的,电子的激发前的状态中的地面位置的概率。被称为镜像规则,则说明这个概念,在图3的排放转换(蓝线)从最低振动能级的激发态回到基态的各种振动水平。将得到的发射光谱(红色条带)是显示由假想的生色团的吸收光谱的镜像图像。

fluorescenceintro figure4

在许多情况下,由高能量光子激发导致较高的电子和振动水平(S(2) S(3) ,等),从而迅速失去多余的能量,作为荧光团放松的最低振动能级的人口第一激发态(见图1)。由于这种快速弛豫过程,发射光谱通常是独立的激发波长(一些荧光团发射从更高的能量状态,但这种活性是罕见的)。出于这个原因,发射是最低激发态跃迁的接地状态,但是不是整个的吸收光谱,其中可能包括转换到较高的能量水平的镜像。镜像规则的一个极好的测试是检查中的线性图的波数(波长或在每厘米的波的数目的倒数),这是直接正比于频率和量子能量的吸收和发射光谱。当以这种方式(参见图3),消光系数和涉及相互转换时作为一个功能的能量产量镜像光谱的激发和发射光谱的强度之间的对称。

图4中的奎宁的吸收和发射光谱,自然发生的抗疟疾剂(第一个已知的荧光团)最初于1845年由约翰·弗雷德里克·威廉·郝薛尔的荧光性质。的奎宁不坚持镜像规则,这是显而易见通过检查单峰的发射光谱(460纳米),这并不反映在两峰在双峰吸收光谱在310和350纳米的特色,。更短的波长的紫外线吸收峰(310纳米),是由于激发过渡到第二激发态(从S(0) S(2) ),迅速松弛到最低激发态(S(1) )。其结果是,会发生荧光发射专门从最低激发单重态(S(1) ),从而在一个频谱镜像地面,奎宁第一激发态的过渡(350纳米的峰值),而不是整个的吸收光谱。

由于与荧光发射转换(参见图1-4)相关联的能量通常是小于吸收,得到的发射的光子具有较少的能量,并移动到更长的波长。这种现象通常被称为斯托克斯位移,并普遍采用的解决方案的调查,几乎所有的荧光基团发生。的斯托克斯位移(Stokes shift)的主要来源是激发电子的S(1)激发态的最低振动能级的快速衰变。此外,荧光发射通常是伴随着由转换到更高的振动能量水平的地面状态,导致在热平衡的多余的振动能量的激发能量的进一步损失。其他事件,如溶剂的取向效应,激发态的反应,形成复合物,和共振能量转移,也可有助于较长的发射波长。

斯托克斯位移(Stokes shift)在实践中,被测量为在一个特定的荧光染料或荧光团的激发和发射光谱的最大波长之间的差异。的移位的大小不同的分子结构,但可以从几纳米到几百纳米的范围内。例如,对于荧光素的斯托克斯位移(Stokes shift)是约20纳米,而移位奎宁是110纳米(参见图4),卟啉是超过200纳米。斯托克斯位移的存在是非常高的灵敏度的荧光成像测量的关键。红色发射移位精度带宽的光学过滤器的使用,使到达检测器,以有效地阻止激发光从相对微弱的荧光信号(具有低发射的光子数),所以可以观察到对一个低噪声的背景。

消光系数,量子产率和荧光寿命,

在描述和比较荧光常用的三个基本参数的消光系数(ε),量子产率(Φ),和荧光寿命(τ)。摩尔消光系数被广泛采用光谱,显微镜和荧光的字段中,以转换成的各种化学物质的摩尔浓度的单位的单位的吸光度。的消光系数确定为1摩尔浓度 M )(1摩尔每升)的目标化学品具有一厘米的路径长度中的比色皿,通过测量在参照波长(吸收分子的特征)的吸光度。参照波长通常是紫外线或可见光光谱中的最大吸收波长。消光系数是荧光团,以吸收光的能力的直接量度,和那些具有高消光系数的生色团也具有高的荧光发射的概率。此外,因为荧光团特性寿命(在下面讨论)是成反比的消光系数,表现出高的消光系数的分子激发态和一个短的固有生命期。

量子产率(有时会错误地称为量子效率)是一个计量表来测量的效率的荧光发射相对放松的所有可能的途径,一般表示为发射到吸收的光子数的光子的比(无量纲)。换句话说,量子产率代表一个给定的激发的荧光染料将产生的发射光子(荧光)的概率。的量子产率通常范围之间的一个零值,并且通常使用的荧光分子作为探针在显微镜有范围从非常低(0.05或更小),以几乎统一(最亮的荧光基团)的量子产率。高量子产率在一般情况下,在大多数成像应用中是可取的。一个给定的荧光团的量子产率变化,有时大极端,与环境因素,如pH值,浓度,和溶剂极性。

fluorescenceintro figure5

的荧光寿命为特征的分子仍然处于激发态返回到基态的时间是一个指标提供的信息,将收集到的排放概况。在激发态的寿命,荧光发生构象变化以及与其它分子和漫过当地的环境进行互动。用短暂的光脉冲激发的分子在一个统一的人口的作为时间的函数的荧光强度的衰减是由一个指数函数描述:

I(t) = Io • e(-t/τ)

其中I(t)的是在时间的测得的荧光强度,I(o)激发后立即观察到的初始强度,τ是荧光寿命。正式地说,是指在一定时间的荧光寿命,其中的初始荧光强度的荧光衰变的初始强度的1/e(约37%)(参见图5的(a))。这个量是从激发态到基态的荧光衰减的速率常数的倒数。

由于水平的荧光分子的激发单重态的数目成正比,寿命测量可以通过测量经过短暂脉冲激发的荧光衰减进行。在均匀的溶剂,荧光衰减通常是一个单指数函数,如示出的荧光强度的图,图5(a)和图5(b)中作为时间的函数的。更复杂的系统,如活组织和活细胞,包含一套混合的环境中,往往产生多指数的值(图5(c))时,荧光衰减测量。此外,还有一些其他进程竞争与荧光发射返回到基态,激发态电子,包括内部转换,磷光(间窜跃)和淬火。除了荧光和磷光,非辐射过程的主要机制是放松的激发态电子。

所有非荧光进程的争夺的激发态电子的失活,可以方便地组合成一个单一的速率常数,称为非辐射速率常数和变量k(nr)所表示。非辐射速率常数通常会忽略任何从振动弛豫的贡献,因为这些转换是快速的速度(皮秒)的几个数量级的速度比慢失活(纳秒级)转换。因此,现在可以被表达的量子产率,速率常数是:

Φ=光子发射/吸收光子= kf/(kf + knf) = τf/τo

其中K(F)是用于荧光衰变(符号Γ也用于指定该速率常数)的速率常数。的衰变速率常数的倒数等于内在的生命周期T(O) ),它被定义为激发态的寿命在所有进程的情况下,竞争激发态失活。在实践中,由非辐射过程的荧光的激发态寿命缩短,导致测得的寿命(T(f)),这是一个组合的内在寿命和竞争的非荧光弛豫机制。由于测得的寿命总是不到的内在一生,量子产率从来没有超过价值的统一。

光学显微镜中使用的共同的探针有许多以纳秒为单位测得的荧光寿命,但这些可以在宽范围内变化,这取决于分子结构,溶剂,和环境条件。定量荧光寿命测量,使研究者具有相似的光谱特征,但不同的生命周期的荧光团之间的区别,并且还可以对当地环境的线索。具体而言,在探头附近的pH值和浓度的离子可确定不知道的本地化的荧光基团的浓度,这是使用时,与活细胞和组织的探针浓度可能不是均匀的显著好处。此外,寿命测量是不敏感的漂白文物比强度测量。

淬火和漂白

淬火和光漂白的后果是有效地减少排放量,并在设计和执行荧光调查,应该是首要考虑的。这两种现象往往是不同的淬火而漂白是不可逆的。猝灭来自各种竞争的进程,诱导到基态时,这可能是在本质上是分子内或分子间的非辐射弛豫(没有光子发射)的激发态电子。由于非辐射跃迁途径竞争与荧光弛豫,他们通常显着降低或者,在某些情况下,完全消除发射。大多数的淬火工艺的作用,以减少激发态的寿命和受影响的荧光量子产率。

一个常见的例子观察淬火与激发态的荧光团和另一个(非荧光)在溶液中,产生的荧光团的失活,并返回到基态的分子的碰撞。在大多数情况下,既不的分子的化学变化中的碰撞猝灭过程。各种各样的简单的元素和化合物的行为作为碰撞猝灭剂,包括氧,卤素,胺,和许多缺电子的有机分子。碰撞淬火可以揭示存在局部淬灭剂分子或基团,通过扩散或构象的变化,可能发生碰撞的荧光在激发态的寿命。碰撞淬灭的机制,包括电子转移,自旋-轨道耦合和系统间交叉的激发三重态。经常使用的其他术语交替与碰撞淬火内部转换和动态猝灭。

fluorescenceintro figure6

第二种类型的猝灭机制,被称为静态复杂的淬火,来自非荧光配合物之间形成的,用来限制通过减少人口的活性,可激发的分子吸收的淬灭基团和荧光基团。产生这种情况的荧光物种时,形成了一个可逆的络合物与猝灭剂分子在基态,并且不依赖于扩散或分子碰撞。在静态猝灭,荧光发射的减少而改变激发态的寿命。荧光基团处于兴奋状态,也可以偶极共振能量转移机制终止时,在邻近的受体分子激发态能量可转移到非辐射。在某些情况下,可以通过非分子机制,如衰减的入射光的吸收的物种(包括发色团本身)发生淬火。

以淬火相反,光漂白(也称为衰落)荧光团时,会发生永久地失去荧光由于光子诱导化学损伤和共价修饰的能力。从激发单重态到三重态的过渡后,荧光基团可以与另一个分子相互作用,以产生不可逆的共价修饰。相对长寿命三重态相对于单重态,从而使激发态分子发生化学反应,在环境中的组件的一个更长的时间范围。的激发和发射周期所发生的一个特定的荧光漂白前的平均数量取决于分子结构和当地的环境。一些荧光基团快速漂白后只发射一个光子,而更健壮的人,可以进行漂白前的数千或数百万个周期。

图6给出的是光漂白(褪色)中观察到的一系列的数字拍摄的图像,在不同的时间点为乘法染色培养牛肺动脉上皮细胞的一个典型例子。用4,6 -二脒基-2 -苯基吲哚(DAPI,蓝色荧光)的细胞核进行染色,而染色的线粒体和肌动蛋白细胞骨架与MitoTracker红(红色荧光)和鬼笔环肽衍生物(绿色荧光),分别。时间点取在两分钟的时间间隔,使用荧光过滤器的组合与调整,以激发荧光基团,同时也记录合并发射信号的带宽。请注意,所有这三个荧光具有相对高的强度,在图6(a),但DAPI(蓝色)的强度开始迅速下降,在两分钟,以六分钟,并几乎完全消失了。线粒体和肌动蛋白的污渍更耐漂白,但强度都下降的过程(10分钟)的时间序列。

光漂白事件的一类重要的是光动力,这意味着它们涉及的荧光团的相互作用与光线和氧气的组合。永久性的破坏荧光荧光基团和分子氧之间的反应产生自由基单线态氧的化学物种,可以修改其他分子在活细胞。光致漂白的量由于光动力事件是分子氧的浓度和荧光基团,氧分子,和其他细胞成分的近端之间的距离的函数。光漂白,可以减少通过限制荧光照明的曝光时间,或通过降低能量的激发。然而,这些技术也减少了可测量的荧光信号。在许多情况下,溶液的荧光团或细胞悬浮液可以脱氧,但活细胞和组织,这是不可行的。也许是最好的保护,防止光漂白是限制暴露的荧光激烈照明(使用中性密度过滤器),耦合与明智地使用市售的抗淬灭,可以被添加到安装溶液或细胞培养基中的试剂。

在某些情况下,也可以被利用的光漂白效果来获得特定的信息,否则不会提供。例如,在后荧光恢复光漂白(FRAP)的实验中,一个目标区域内的荧光团是有意照射过量的漂白。随着新的荧光基团的分子扩散到漂白区域的检体(恢复),荧光发射强度进行监测,以确定目标荧光团的横向扩散率。在这种方式中,平移的荧光标记的分子的流动性,可以是一个单细胞或生物体组织部分(2至5微米)的一个非常小的区域内确定。

 

溶剂效应的荧光发射

各种环境因素的影响的荧光发射,包括荧光团之间的相互作用和周围的溶剂分子(取决于溶剂极性),其它溶解的无机和有机化合物,温度,pH值,和本地化的荧光物种浓度。这些参数的效果有很大的不同从一个到另一个荧光团,但大量的吸收和发射光谱,以及量子产率,可以由环境变量的影响。事实上,高灵敏度的荧光度,主要是由于在本地环境中的相互作用,发生在激发态的寿命。荧光基团可以被认为是一个完全不同的分子激发态(比基态),因此将显示另外一组性能方面相对于基态的激发态与环境的相互作用。

在溶液中,也有周围的溶剂分子的基态荧光团,可以与荧光团,得到的有序分布的周围的荧光基团的溶剂分子的偶极矩的偶极矩。中的荧光团的基态和激发态的能级之间的差异产生的分子的偶极矩的变化,最终诱导周围的溶剂分子的重排。然而,在Franck-Condon原理决定,激发荧光团时,分子被激发到一个更高的电子能级在远远短的时间内,它需要比内的溶剂 - 溶质的荧光团和溶剂分子的重新定位自己互动环境。作为结果,存在一个时间延迟之间的激发事件和溶剂分子周围的溶剂化的荧光团(如在图7中示出),它一般具有大得多的比处于基态的激发态中偶极矩的重新排序。

fluorescenceintro figure7

后的荧光团被激发到较高的振动水平的第一单重激发态(S(1) ),过量的振动能量被迅速失去周围溶剂 ​​分子作为荧光团慢慢松弛到最低的振动能量(发生在皮秒时间规模)。溶剂分子协助稳定并进一步降低周围的激发荧光团在一个较慢的过程,需要在10和100之间皮秒重新定向(称为溶剂松弛)的激发态的能量水平。这样做的效果减少态和激发态,这将导致在一个红色的移位(向长波长)的荧光发射之间的能量分离。增加溶剂的极性,产生激发态的能量水平的相应较大的减少,降低溶剂极性的同时,降低了激发态的能量水平的溶剂效应。的荧光基团的极性也决定激发态的灵敏度的溶剂效应。极性和电的荧光基团表现出更强的效果比非极性的荧光基团。

荧光的溶剂放松的效果,可能会导致显着的影响Stokes位移的大小。例如,该杂环的氨基酸色氨酸的吲哚部分通常驻留在其中周围介质的相对极性低的蛋白质的疏水性内部。用热或化学剂的一个典型的宿主蛋白的变性后,色氨酸残基被改变的环境从非极性高极性,在吲哚环地出现在周围的水溶液。荧光发射波长约330纳米至365纳米,35纳米的转变,由于溶剂效应增加。因此,可以采用发射光谱的内在和外在的荧光探针探测溶剂极性的影响,分子协会,并具有极性和非极性的小分子和大分子的复合物的形成。

荧光定量调查应不断监测,以扫描潜在的排放概况的变化,甚至当他们不打算,也没有预期。在简单的系统,可以建立一个均匀的浓度,渐进式发射强度增加,应遵守的函数的荧光浓度增加,反之亦然。然而,在复杂的生物系统中,可能会发生变化的荧光探针的浓度本地在很宽的范围内,并且强度波动或光谱的移位往往因pH值的变化,钙离子的浓度,能量转移或猝灭剂的存在下,而不是荧光团化学计量学。意想不到的溶剂或其它环境的影响的可能性,应始终被视为在评价的结果的实验程序。

荧光各向异性

荧光发射从各种各样的试样成为偏振光内在或外在的荧光团时,被激发的平面偏振光。偏振光发射的电平中所述的各向异性方面,显示一定程度的各向异性的标本,也表现出可检测水平的偏振光发射。荧光各向异性的观察与测量的基础上的光选择性激发的荧光基团由于瞬态取向与取向的电场矢量(偏振光)的照明的光子的吸收偶极矩。当荧光团吸收的入射的光子,激发事件从入射的辐射的振荡电场成分和创建的荧光团的分子轨道的电子状态的跃迁偶极矩之间的相互作用产生。荧光团优先吸收那些光子具有的电场矢量平行排列的荧光团的吸收跃迁偶极矩。

fluorescenceintro figure8

荧光发射,也会发生在一个平面上的发射跃迁偶极矩的方向所定义的。每个荧光团已固定在其分子框架内的吸收和发射跃迁偶极矩(图8),其中已经定义了相对于中的染料分子的分子轴的方向,并彼此分开的角度(θ)。呈现在图8是一个假设的三核的芳族杂环基的荧光团(布置类似吖啶环系统)用箭头表示的空间关系的吸收(黄色箭头)和发射(红色箭头)跃迁偶极矩矢量重叠。在激发态的寿命(τ)中,荧光团的旋转将其排放到激励矢量相对于去极化,导致在测量环境中含有的荧光团的刚性的一种机制。

含有随机取向的荧光团与平面偏振光的各向同性溶液的照明将优先激发只有那些分子的吸收跃迁偶极矩平行对齐的(或接近)的偏振向量电平面。吸收的概率实际上是偶极子和入射光的电场矢量(吸收为最大时的角度为零度和达到最小的角度接近90度)之间的角度的余弦平方成正比。其结果将是一个人口激发荧光基团从原来的合奏一个的特定photoselection过程中,产生激发态荧光基团面向一个特定的轴平行。从该亚群的荧光发射也将是部分偏振。测量的激发和发射跃迁偶极矩之间的相对角的偏振(p)或各向异性(ŕ)确定的程度,如由等式给出:

p = (I|| - I)/(I|| + I) and r = (I|| - I)/(I|| + 2I) 

其中,I(| |)激发的平面平行的平面中测量的荧光发射,I(⊥)激发的平面垂直的平面中测量的荧光发射。在实践中,偏振光的量计算通过测量发射激励光路径中放置的偏振器和分析器对取向平行或垂直于激发偏振器(参见图9)中的发射光的路径下收集。各向异性和偏振都表达同样的现象和值可以很容易地相互转化。的各向异性的表达是优选的,因为在大多数情况下,相关联的数学方程是简单表示时,在此参数方面。

因为发射跃迁偶极矩是从激发跃迁矩位移由于空间定向(参见图8),将发生某种程度的去极化,即使荧光团被固定在适当位置。因此,吸收过程本身是荧光去极化的第一源极。旋转运动的荧光,它总是发生在激发态的寿命,更多的人流离失所的发射跃迁偶极方向从原来的结果,将进一步降低观测到的排放各向异性。的旋转速率是依赖荧光基团(或它的约束的大分子)的大小和其本地化环境的粘度。可以与由佩兰方程的荧光团的旋转流动性的​​溶液的荧光各向异性:

r0/r = 1 + (RTτ)/(ηV)

其中,R(0)是限制各向异性(中观察到的情况下的任何荧光旋转的各向异性),r是测得的异向性,η是粘度的环境 V 是在旋转的分子的体积 R 是通用气体常数 T 是该溶液的温度的绝对温标上,和τ的荧光的激发态的寿命。在实践中,佩兰方程简化表达的时间依赖性的衰减的各向异性方面的旋转相关时间Φ)的荧光团:

r0/r = 1 + τ/Φ where Φ = (ηV)/(RT)

其中的现象,导致(低级),测得的荧光各向异性值脱离的最大的理论极限是天然的分子旋转扩散的过程中发生的激发态的寿命。在溶液中,分子量小的荧光团(最多到几千道尔顿)的旋转相关时间范围在50和100之间皮秒,这是显着的速度比的发射和位移率,或随机分布,发射跃迁偶极矩。因为一个典型的荧光基团的平均激发态寿命是在纳秒范围,分子是能够旋转无数次之前排放。其结果是,偏振光发射是随机的,因此净各向异性为零。第二个(但更罕见)机制通常所观察到的各向异性下降是荧光基团之间的激发能转移。

协会的荧光团与一个更大的大分子的查询结果中的旋转相关时间的显着增加。在大多数情况下,一个大的蛋白质在溶液中的相关时间范围从10到50毫微秒,其中等于或超过一个典型的荧光基团的平均激发态寿命。荧光团的结合减慢的荧光探针的旋转运动,使主机蛋白的旋转相关时间的调查。较小的蛋白质通常显示比较大的蛋白质,或蛋白质涉及复杂的生物组件的相关性时间要短得多,并且可以预计将产生较低的各向异性。

fluorescenceintro figure9

用光学显微镜测量荧光偏振的工具的方法,提出在图9中。平面偏振光的激发光产生的通过电弧放电照明灯的光通过一个线性偏振器。荧光在试样(在显微镜载玻片上)偶极矩的吸收的激发光的平面平行取向的平面偏振光的激发光被吸收最大。这将导致在一个特定的子群的荧光基团被激发(荧光基团的各向异性集合)。在理论上,所有的激发的荧光基团具有相同的方向,吸收和发射偶极矩。在相对于激励照明的偏振平面平行和垂直的方向测量,其随后发射的荧光团的荧光。由于荧光团的旋转在其激发态寿命期间,观察到的发射水平平行的平面的激发会不断减少,而排放量的记录垂直于平面的激发将同时增加。

正如上面所讨论的,荧光各向异性测量可以提供上的旋转流动性的​​蛋白质,其分子量和形状可以推断出的信息。此外,分子间的关联可以被监测,以及构象变化和蛋白质变性。该技术也被审查内部蛋白质的灵活性和数量的生物膜的物理性能,包括粘度,相变,化学组合物,和对这些性能的膜扰动的影响。可以稳态系统采用连续照明时间分辨实验中利用脉冲激发事件的荧光各向异性的测量。

共振能量转移

甲在激发态的荧光基团如上面所讨论的,可以失去激发能量通过将其转换成光(荧光),通过热平衡(振动弛豫),或转移到另一分子通过碰撞或复合物的形成(非辐射耗散和淬火)。以形成复合物或与溶剂分子碰撞,由耦合之间的荧光团和第二个分子的电子轨道的能量被转移。也有另一种过程,称为共振能量转移(RET),其中在激发态的荧光基团(称为供体)可以其激发能转移到相邻的发色团(受体)的非辐射通过远距离偶极-偶极在纳米测量距离的交互。假设共振能量转移的供体荧光团的基本理论,可以被视为一个振荡的偶极子,可以将能量转移到类似的偶极子在一个特定的共振频率中的类似的方式耦合振子的行为,如对音叉振动在相同的频率。

共振能量转移是潜在可能时,供体荧光团的吸收光谱的受体,这本身不一定是荧光重叠的发射光谱。了解这种机制的能量转移的一个重要概念是,加工过程中不涉及捐助随后的受体发出的光子的吸收光的发射。换句话说,不存在中间的共振能量转移的机制参与光子。表现的能量转移的供体荧光发射在受体的存在下和提高(敏化)的排放,受体荧光猝灭双方。

fluorescenceintro figure10

呈现在图10的分光公司从耦合发生共振能量转移的供体和受体分子的发光强度的变化。的过程中发生重叠(灰色区域)之间的供体发射(中央灰色曲线)和受体吸收光谱的(中心黄色曲线)是必需的。当这种重叠是存在的,供体和受体的分离小于10纳米,供体的激发能可转让的非辐射的受体。净结果是淬火的供体荧光发射(红色曲线)和受体(致敏发射的发光强度增加,红色虚线曲线)。个人光谱的供体和受体在图10中可以使用传说中的上左上角的数字标识。

共振能量转移的效率随光谱重叠的程度,但最重要的是,作为第六功率的距离(半径)的逆的供体和受体生色团分离。受体的能量转移到需要的生色团之间的距离比较接近,为1至10纳米的边界内的限制。激励标记的试样的照明的波长相对应的供体和受体的峰值发射波长区域中检测荧光发射的吸收(激发)最多可以检测到的现象。或者可以测量的受体的存在和缺乏,供体的荧光寿命。能量传递效率上的供体和受体之间的分离距离的依赖,提供细胞生物学的研究中的实用程序的共振能量转移的基础。此方面的共振能量转移,使可以使用的技术来作为分光标尺研究和量化细胞成分之间的相互作用,以及在单个大分子的构象变化,在分子水平上。

必须建立一组特定条件发生共振能量转移。供体生色团必须是能够耦合到一个足够长的寿命与合理的量子产率的荧光,施主和受主分子之间的距离必须是相对较短(在大多数情况下,只有几纳米)。此外,如上面所讨论的,设计的共振能量转移调查不涉及受体所考虑的实际的光的重吸收。率(K(T) )的能量转移和能量转移效率(E(T) )都有关的供体中的受体的存在或不存在的寿命。能量转移的速率常数,表示为:

KT = (1/τD• (R0/r)6

其中,R(0)福斯特距离至关重要的,这是其中的能量转移的概率等于捐助激发率(衰减)的受体在没有的施主-受主分离半径。因此,福斯特距离,通常大多数共振能量转移测量范围2和7纳米之间,是能量转移的效率是50%的发色团之间的距离。另外,在方程中,τ(D)是使用的变量来表示在没有受体的供体的寿命,  r 是分离的施主和受主分子的距离。通过检查等式中,很明显的共振能量转移率是等于受体没有捐助衰减率(倒数的寿命)时,发色团之间的半径是等于福斯特距离。此时,转移效率为50%的供体发射将减少到二分之一的受体的情况下的正常强度。由于能量转移率的分离距离的6次方成反比,供体和受体之间的接近程度是清楚的主要术语。临界福斯特距离,以纳米表示,按照以下方程来计算:

R0 = 2.11 × 10-2 • [η-4Q0κ2J(λ)]1/6

福斯特距离方程引入κ2κ平方),这是一个描述在三维空间中的供体和受体的吸收和发射偶极子之间的空间关系的取向系数的概念。如果偶极取向之间的两个发色团(由于快速旋转的施主和受主分子)是随机的,取向因子取统计平均等于(三分之二或0.67的值)对于大多数计算R(0)。发生能量转移的介质的折射率被表示为变量η,和Q(0)是在没有受体的供体的量子产率。重叠积分,J(λ)中,定义的供体发射和受体的吸收光谱(图10中所示的灰色阴影区域)之间的重叠区域。能量传递效率(E(T) )相关的距离分离的供体和受体 R ),由以下方程:

r = R0[(1/ET) - 1]1/6 where ET = 1 - (τDA/τD)

因此,通过测量在受体(τ(DA) )的存在下和无受体(τ(D) )的供体的荧光寿命,可以分离两个生色团的能量传递效率和距离确定。由于共振能量转移的效率在很大程度上受供体和受体的扩散供体的生命周期,时间分辨测量是最适合的空间波动系统的分析。转印效率,也可以测定由稳态的技术,使用的供体中的受体的存在和不存在的相对荧光发射强度。然而,这些计算是有限的供体和受体的情况下,由一个固定的距离分离,如当两个发色团被绑定到相同的大分子。这是不绑定到不同的蛋白质或蛋白质和核酸的酸,其中的时间分辨的信息通常是必要的情况下,供体和受体。同样地,对于在溶液中的发色团的混合物,或随机分散在膜中,更复杂的计算,考虑空间分布的分子的平均传输率是必要的。

共振能量转移调查提供独特的信息相比来自替代实验涉及荧光各向异性,溶剂松弛,淬火,或最激发态反应。荧光定量测量的大多数依赖于短距离在附近,包括周围的溶剂分子的荧光团和其他分子之间的相互作用。与此相反,溶剂的影响,甚至大的大分子(如蛋白质或核酸)的存在下有供体和受体之间的能量转移的效率上的影响不大。测量共振能量转移的主要考虑因素,与其他技术不同的是,实际的供体和受体分子之间的物理距离。

结论

即使出现的荧光现象,几乎是瞬时的,与当前仪器吸收光子并和由荧光团的第二个光子的发射之间的相对长的时间内打开的门,有相当数量的调查使用此显着的方法。调色板中的荧光技术的吸收和发射光谱,量子产率的明显变化,生存,淬火,漂白,各向异性,能量转移,溶剂效应,扩散,形成复合物,以及一系列的环境变量。所有这些因素都可以很容易地评估通过稳定状态或内在的和外在的荧光基团的光谱特性,时间分辨的解释。

当耦合到光学显微镜,荧光,研究人员在细胞生物学研究一个广泛的现象。最重要的是亚细胞的组件,如细胞核,细胞膜,细胞骨架的长丝,线粒体,高尔基体和内质网中的特定的大分子的细胞内分布的分析。除了稳态细胞解剖观察,荧光探测细胞内的动态和各种大分子之间的相互作用,包括扩散,结合常数,酶促反应速率,以及各种不同的反应机理,也是有用的,在时间分辨测量。其他重要的进程也调查的高度特异性和空间分辨率可与荧光显微镜使用的目标。例如,荧光探针已被用来监测细胞内的pH值和本地化重要的离子浓度,细胞存活率和凋亡率的影响因素的研究和。同样的,重要的细胞功能,如内吞作用,胞吐,信号转导和跨膜电位的产生,荧光显微镜下研究。在审查大量的应用程序受益于荧光分析,荧光显微镜的显着效用是明显的,为什么推动了这项技术的最前沿生物医学研究。