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尼康显微镜:活细胞成像对光学系统和CCD的要求

2013-10-16  发布者:admin 

在活细胞研究设计的光学显微镜系统,主要考虑检测器的灵敏度(信号与噪声),图像采集所需要的速度,以及标本的可行性。相对较高的光照强度和较长的曝光时间,通常采用固定的细胞和组织(如漂白是主要的考虑因素)中记录图像时,必须严格避免与活细胞。在几乎所有的情况下,活细胞显微代表了一种妥协之间实现最佳的图像质量和保持健康的细胞。不必要的过采样的时间点,使细胞含量超标的照明,空间分辨率和时间分辨率的实验,而不是应限制在调查的物镜相匹配的。

imaging systems figure1

原则上,理想的活细胞图像采集系统是不够敏感,从弱荧光样品,同时足够快的速度来记录所有动态过程,获得高品质的图像。此外,该系统将有足够的分辨率捕捉最细微的标本细节能够准确测量非常微小的差异在强度和较宽的动态范围。不幸的是,仅完成优化这些条件中任一项在牺牲其他。因此,目前不可能设计一个通用的活细胞成像系统,这将是理想的整个范围内的可能的调查。相反,研究人员必须妥协,确定最重要的参数进行优化,同时还试图限制由这些变量被认为不太感兴趣的牺牲。显微镜配置在最后,最终确定所要求的摄像模式(s)时,生活必需品保持试样在实验期间,标记协议的难度级,和设备的可用性的可行性。

 

示于图1,是一个现代的倒置研究级组织培养显微镜配备4相机端口,每个端口耦合到一个不同的相机设计用于特定的成像模式。在大多数情况下,这种设计直接是100%的端口(一个端口在同一时间)的光显微镜或分裂的相机端口和目镜的光80:20之间。对于在低光照水平的关键的成像,研究者应确保最敏感的相机被连接到一个端口接收由样品发射的光100%。在图1中,全彩色CCD相机连接到的底部端口(一)接收来自物镜的光不反射的反射镜或棱镜,并在这种情况下,采用图像乘以在明视场模式下的标记的荧光的标本(或染色标本) 。高性能电子乘以数字(EMCCD)相机(二)安装到右侧端口上使用的图像标本显示出非常低的水平的荧光。微分干涉对比成像深入厚的组织与红外照明,照相机((c)的左侧端口))具有传感器具有高的量子效率在7001000纳米之间是必需的。最后,用于高分辨率单色成像通过全内反射和其他荧光技术,珀耳帖(Peltier)冷却的摄像头((四);前端口)相对小的像素(6微米)是理想的。的配置,如在图1中所示的是昂贵的,但也可以是极其通用的核心成像设施。

 

使用广泛的对比增强成像模式,在光学显微镜进行活细胞成像。调查的大部分涉及某种形式的荧光显微镜,往往联接到一个或多个发送的光技术。荧光技术,包括传统的宽视场落射荧光,激光扫描共聚焦,旋转盘,横扫领域聚焦,多光子,全内反射(TIRF),荧光相关光谱,荧光寿命成像(FLIM),光活化,和激光捕获。作为一个子集,专门的成像方法,如多色成像,光谱成像,共定位,延时序列,漂白恢复技术(FRAPFLIP FLAP),共振能量转移(FRET),斑点显微镜(FSM),膜片钳往往是耦合到主成像模式中的一个或多个。可以辅以荧光技术传统的明视场模式下,包括微分干涉相差(DIC),霍夫曼调制反差(HMC),相位相反的,作为荧光探针本地化的确认。在几乎所有情况下,每个的显微镜配置需要一些独特的考虑,必须实现成功的活细胞成像。无论显微镜和成像活细胞和组织采用的数字照相机系统,两个最重要的限制因素是维持细胞生存力和实现可能的最高信号电平以上的背景噪声和自发荧光。

 

 

优化信号与噪声在活细胞成像

成像固定和活细胞之间的基本区别之一是,前者的研究者提供了充足的纬度定义图像采集参数,如寻找一个合适的视野,并确定曝光时间,以及调整电子增益设置,读出率,和偏移值。其结果是,它在大多数情况下是可能的(与充分染色固定标本)获取利用的全动态范围的照相机系统的图像,从而产生最佳的信号 噪声比。不幸的是,情况是不同的成像参数所施加的严格要求,保持细胞活力,活细胞的限制。常常与活细胞的获得的图像中,试样的强度只有几个灰度级高于背景。在这种情况下,最重要的摄像考虑成为暗电流和读出噪声水平的检测器系统。经济的相机通常具有更高的噪声水平,导致经常掩盖从检体,作为增加的读出速度的效果越来越严重的信号不太均匀的背景图像。在几乎所有活细胞成像,探测器的选择是最重要的成功或失败的实验。

 

在数字成像的噪声出现的四个主要来源来自检测器,照明系统,泊松拍摄的噪声(由于一个光子通量的随机性)和杂散光。在大多数情况下,系统的噪声减少,可以实现通过仔细选择的检测器和优化的照明条件。几乎每一种类型的光子探测器到各测量记录与设备引入某种形式的噪音。在激光扫描和多光子显微镜采用光电倍增管可以产生杂散的电子信号放大系统内的。同样地,使用的电荷耦合器件(CCD)在宽视场,反卷积,内部全反射,旋转盘,和扫频场显微镜显示出暗电流与每个像素相关联的背景。在CCD和光电倍增管设计的改进,包括冷却装置,以非常低的温度,减少了暗电流的贡献,以非常低的水平。然而,尤其是在每个像素的CCD的情况下,阅读和将模拟信号转换成数字相当于贡献了额外的噪声分量被称为读出噪声,在当前一代的冷却的数码相机系统的主要噪声伪像。

imaging systems figure2

如图2所示,在活细胞成像与读出速度和图像质量是相互依存的数字摄像机的灵敏度。标本是一种文化的人宫颈癌细胞(HeLa细胞线)表达的融合荧光蛋白基因和人α -微管蛋白的宽视场成像中的荧光照明与TRITC滤光镜组合和灰度摄像系统工作在读取速度,单体Kusabira橙色(人民圣战者组织101.25兆赫。当相机CCD关门(接收没有光),背景噪声是显着降低时,采用的读出速度慢,在图2a)和2b)在分别为101.25兆赫的速度,所描绘。这种差异不严重影响相机的性能时,曝光时间可以调整到利用的整个动态范围,如在图2c)和图2d)中提出的图像类似的质量证明。然而,在低光照条件下,读取速度较慢(图2f))提供优异的图像质量。在图2e)和2条(f)的图像捕获约低10倍比那些在图2c)和图2d)的光强度。减少的照度水平另一个5倍的产生的效果表现得更为明显,如示于图2g)和2h)中的读出速度较慢提供了勉强可以接受的图像(图2(小时)),而快速读出模式(图2g))没有。

 

一个成功的数字成像实验需要的空间照明模式的标本是恒定的整个视野之间连续的影像。根据照明源,横跨试样字段的光学性质通常是相当恒定的(称为空间不变性)显微镜使用钨卤素灯。然而,在激光扫描显微镜,传送到一个特定的像素的照射剂量可以为每个扫描变化。此外,汞等离子弧放电灯源通常采用在宽视场荧光显微镜不提供均匀的强度,在整个频谱,但在特定的波长,而不是产生离散的高强度的峰。氙气灯,与此相反,显示出更为均匀分布的强度分布图的可见光谱范围内,但在紫外区域(通常避免在活细胞成像的照明范围)有缺陷。

 

组合弧放电灯(例如,金属卤化物灯),具有的属性之间的中间的汞和氙的混合物,显示出这两个物种也许是最好的特性,除了提供一个连续的光谱,从紫外到红外强大的汞线。不管的光源,照明场可呈现几乎均匀的通过灯箱和显微镜光学火车照明输入端口之间放置一个光学纤维(或液体光导)。任何剩余的照明梯度整个视野可以通过计算校正使用平场的算法。重要的是要注意,在灯的输出功率的时间的变化,它可以改变从平均10%,不校正由光学纤维和需要的应用程序的一个稳定的电源。

 

光子通量的测量本质上是一个统计过程中,与信号检测的不确定性因素。称为泊松拍摄噪声(如上面所述)的净效果是,对于N光子的测量,不确定性等于N,这也是的信号-噪声比的平方根。最大化的信号的光子数 N )直接导致在信号与噪声和图像对比度的改进。提高信号的最简单的方法是收集更多的光子,通常是通过采取更长时间的曝光,或通过增加励磁照明水平,但这些措施也可以增加光毒性和妥协细胞存活率。第二,也许更有益的选择,是为了提高探测器的灵敏度。

 

为了克服低光水平与活细胞成像,现代数字CCD相机可以配置提供一个实施的过程被称为分级(详见图3和图8),显着提高了灵敏度。在正常读出时,在CCD的像素的量的水平像素的行转移到读取寄存器中,然后将其按顺序分析。在一个离散化的图像,在图像传感器上的基团中,相邻像素中邻接的(例如,一个2×24×4块)的信号(光电子)被合并,并分配到一个单一的象素值中读出的数组。这是由多个平行的行的像素转移到串行读寄存器(例如,为2×2 binning44×4像素合并两行),然后读取组的23,或多个像素一起实现。在2×2像素合并的情况下,有两倍的分辨率损失,信号增加了四倍,和2倍的改善信号对噪声。显然,改善信号的有限的应用中可以显著,虽然在空间分辨率的成本。

imaging systems figure3

3示出的效果相结合的相邻像素上的空间分辨率和数字拍摄的图像的最终尺寸,使用水平的不断提高像素合并。标本赤麂鹿皮肤成纤维细胞表达mCherrypseudocolored红色荧光蛋白)和人类的β -肌动蛋白,它定位在应力纤维组成的丝状细胞骨架网络的融合是一种文化。作为与荧光蛋白标签,通常观察到的细胞,显示优越的本地化往往是那些表达的融合产物,在非常低的水平,显着降低了可用的信号。随着没有像素合并启用(图3a)),该信号是太低,在曝光时间产生可忽略不计的光毒性和光漂白区分。像素合并2×24×4的逐渐增大的信号电平,但在成本的空间分辨率(图3b)和图3c))。最亮的图像是由分级的8×8个像素(图3d)),但存在激烈的分辨率损失。很重要的一点需要注意的是,图像尺寸按比例减少在分级过程相结合的像素数增加。例如,在图3中未像素合并(1×1)的图像本来是1360×1024像素,而(2×2),(4×4),和(8×8)离散化图像是680×512340所述256,和170×128像素,分别。这些图像已被缩小尺寸时,在图中为了说明的目的。同样地,数码相机,具有512×512的显示尺寸,会产生256×256128×128,和64×64像素的图像,当以类似的方式装仓。

 

分级概念的一个关键点是,除了发生后的分选过程中,因此,即使几个像素相结合,只有一个读事件每股合并像素的读出噪声。相反,如果一个2×2的方块的像素被计算数据收集后的平均值,其结果将是不如像素合并,因为由四个像素中的每一个的单独的读出的噪声贡献。因此,即使分级牺牲空间分辨率,它会导致到的信号噪声比,一个特别有用的优势显着增加时要求低光水平和较短的曝光时间上的光敏细胞进行实验。在活细胞成像的关键参数通常能够检测到微弱的荧光信号,而不是解决这些问题的空间,以便提供图像采集的力度和速度的增加抵消了损失分辨率的分级多。作为一种替代方法,以分级,许多高性能相机使研究者通过阅读只有一个子数组或利息完整的CCD阵列,空间分辨率的同时,减少量的一个有用的机制来保存选定区域,以减少图像采集时间时间细胞暴露于有害的照明。

 

为了克服传统的高性能CCD相机的应用需求快速帧速率拍摄在非常低光水平的缺点,厂商都推出了一种创新的方法,以上的CCD读出噪声地板的微弱的信号放大。通过装有一个片上的乘法增益寄存器,电子倍增的设备(EMCCDs)实现单光子的检测灵敏度,典型的强化或电子轰击CCD的低得多的成本和不损害传统CCD结构的量子效率和分辨率特性。EMCCDs的显着特点是将一个专门的扩展串行寄存器在传感器芯片上,生成乘法增益硅子结构(参见图4)内通过的过程中,碰撞电离。高于的光子产生的电荷被读出的噪声,即使在高的帧速率,并且是适用于任何当前的CCD传感器配置,包括背照式设备。

imaging Systems figure4

EMCCD相机系统的显着优点是,它们是相当便宜制造比加剧的CCD,由于CCD的结构被直接并入到信号放大级。对于关键的活细胞与低强度的信号,如单分子成像中所遇到的,总的内部反射,旋转盘和扫频场共聚焦显微镜,钙或其它离子的通量测定,和时间​​分辨三维显微镜调查EMCCD提供其他传感器,专为低信号电平的显着优势。此外,与传统的荧光成像技术的较高的信号电平的时,的EMCCD系统允许的极端敏感性较低的荧光基团的浓度和/或较低的功率电平,从激励源的应用程序,由此减小了光毒性和光漂白的荧光探针。

 

显微镜的光学系统

显微镜针对活细胞成像的应用都必须配备一个高品质的框架构造坚固的复合材料或铝和应稳定牢固地安装在无振动的平台。光学表面的外观以及组件箱(冷凝器,灯箱,物镜转盘等)应保持干净的状态和周围环境的显微镜时,应无粉尘和低相对湿度。其中连续是必要的活细胞成像的常规程序是确保显微镜光学通路和隔膜对齐使用科勒照明的原则。实验室房间的壳体显微镜的好处,以减少杂散光进入通过目镜的显微镜或所述试样腔室的水平的能力,以减少所有开销照明。

 

电子数码相机系统通常安装到显微镜主体通过使用专门的适配器的一个或多个摄像头端口。研究级显微镜通常配备多个端口,能够同时连接多台摄像机(见图1)。显微镜,采用多种成像模式,使相机的优化配置,为每个对比度增强技术,可以快速访问在必要时,此功能特别有用。在显微镜主体内,反射镜,分光镜,和棱镜的级联策略性定位,以反映图像形成光波的相机的各种端口和目镜。重要的是要注意,任何图像采集期间发送到目镜光这样做在发送到照相机的光的牺牲,从而减少了信号 噪声电平。因此,在显微镜配备的,口方向控制应调整到100%的光发送到相机端口,用于收购有限光子荧光图像。

 

收集从检体的最大的信号,并将其传送到显微镜光学列车的物镜的选择是至关重要的。的光路中,作为反射镜,分束器,投影透镜,滤光镜,和棱镜等的元素数量过多会严重的降低信号被捕获图像中的噪声电平必须保持在绝对最小值。在荧光成像,需要具有非常高的数值孔径的物镜是从检体收集到的光的量最大化。数值孔径,它定义了多少可以收集从一个单一的点光源的光的镜头,可以说是最重要的考虑因素,在选择活细胞成像的物镜。从低倍率(10倍)干物镜油浸版本(通过10040倍)水和1.45 1.20 0.25,此值上刻的客观桶和范围。在数学术语中,数值孔径被表示为:

数值孔径(NA=折射率(η×镜头受光角(罪(θ))

 

因此,由前透镜之间的介质和能够有助于最大衍射光线的角度(θ)的正弦乘以试样的折射率(η)确定的光收集能力的客观图像形成。此外,生成的图像的分辨率,由物镜的数值孔径是一个函数。根据瑞利判据(一个保守的估计),分辨率是等于一个常数(0.61)的照明的波长乘以除以由物镜的数值孔径。另外,数值孔径定义的强度(亮度)的图像,这是与数值孔径的四次幂成正比,但只成反比的,与放大倍数的第二功率。因此,小的数值孔径的增加可以产生显着的改善信号。出于这个原因,活细胞的荧光成像通常需要最高的数值孔径耦合到高折射率浸没介质(油或水)的物镜

 

如上所讨论的,所述信号的亮度的物镜放大倍率的平方成反比,所以,低倍率物镜时,往往是有益的暗淡的样品成像。例如,如果信号 噪声比成为改变到类似的数值孔径的60倍或40倍的物镜将提供显着的改善的亮度的数值孔径1.4,用100倍的物镜成像的标本中的限制因素。事实上,一个特定的荧光特性几乎应该出现三次更明亮时,相对于100倍的物镜(包括具有的数值孔径为1.4)的具有60x的成像。所观察到的强度也是一个函数变化的物镜的传输质量,它始终是值得考虑的放大率和binning在一起,以便评估一个特定的实验中所需的最终倍率。

 

对于成像乘法标记的固定细胞(和在某些情况下,活细胞),在整个可见光光谱(范围从400700纳米;称为复消色差)良好地校正色差,具有平坦的成像平面(称为平场物镜平光)被认为是理想的。不幸的是,复消色差和平场复消色差的物镜,以及那些,用来捕捉更广阔的视野,不可避免地含有多个光学元件(透镜)的比不太精确的物镜消色差透镜荧光)。高度的校正使这些物镜,用于透射光的技术,包括以最小的工件的相对比度和DIC。的结果,但是,光吞吐量牺牲,以获得最佳的光学矫正,因此,有固定细胞成像的影响不大,但往往是反效果的活细胞成像。不足之处是最好的证明的平场复消色差物镜40倍的物镜有一个高数值孔径为1.4,理论上应该约6倍的亮度比一个类似的100倍的物镜,是在实践中只有约4倍,明亮的。无论如何,40x60x物镜仍然提供了明亮的图像可以实现光学分辨率的限制。

imaging systems figure5

 

5中示出的数值孔径的分辨率和图像的亮度方面的重要性的一个例子的原理。的标本是文化附着的非洲绿猴肾上皮细胞(CV-1线)的质粒载体转染增强型绿色荧光融合蛋白的线粒体定位的核苷酸序列,细胞色素C氧化酶亚基第八。的质粒转染的哺乳动物宿主的转录和翻译后,线粒体定位信号是负责运输和分配的荧光蛋白嵌合体整个蜂窝线粒体网络。管状线粒体,随后可应用荧光显微镜。

 

在图5中,相同视野,使用具有相同的光学校正(平场荧光)和数值孔径(1.3)的物镜成像,但放大倍率从40倍到100倍不等。虽然利用在图5中收集的图像的像素和检测器的条件的数目是相同的,线粒体最亮时,通过40倍的物镜(图5a;请注意,图像已被调整到一个共同的的大小)成像。与此相反,更高的放大倍率60​​100倍的物镜(图5b)和图5c)中,分别)产生逐渐变暗的图像,用100倍的图像被几乎不可见。这一物镜仍然可以用作图像试样,但检测器的增益,必须显着增加,导致的信号 噪声比和通常次于图像的劣化。请注意,由于在相同的数值孔径值的物镜的分辨能力(图5d)至图5f))是可比。

 

从图5中的数据,将收集到的主要概念之一是为了避免过度放大时,选择物镜为活细胞成像荧光蛋白(和其它荧光基团,对这一问题)。简单地增加了数字放大(变焦),在激光共聚焦显微镜图像采集,图像大小相当于100倍镜头(图5D)和5e))使用40x60x的客观结果。这两个物镜的分辨率是一样的,因为他们有相同的数值孔径。不应该采取的观点相对次要的放大表明,使用60倍或100倍的物镜是不利于。事实上,选择的高倍率的物镜通常是必要的成像时非常小的物体,如过氧化物酶体或分泌颗粒,使用广角镜。由于相对于检测器的尺寸的图像尺寸起着重要的作用,在确定空间采样频率,最佳倍率确定的参数的数字照相机系统(CCD像素尺寸和中间倍率)。因此,最好的选择的物镜通常依赖于检测仪器的光学配置,除了特定的实验的具体要求。

 

在的情况下的信号 噪声比的分辨率更为关键,它常常是一种更好的选择,利用物镜下校正(更少的光学元件),具有显着较高的光吞吐量。时,应注意也可用于通过包含显着降低光透射的光学元件,如在相衬物镜的振幅减小板的物镜成像。此级别的光减少很少是传输模式中的一个问题,但可以大幅降低的信号电平(由15%至20%),在荧光成像。出于这个原因,相物镜不应该被用于活细胞成像的低丰度的探头除非实验协议要求的相衬和荧光图像的叠加。类似地,当组合使用荧光​​DIC的图像正在收集,偏振光分析仪(其中约30%,降低了信号)通常是在共用的光路定位物镜下方的立即和获取荧光图像之前,应除去。

 

显微镜光学火车存在的任何缺陷将影响在最终图像中的信号噪声比。在活细胞成像与高数值孔径物镜,球面像差是最常见的神器,必须加以克服。此像差产生从洗澡的细胞(通常的折射率为1.33的水溶液)和客观浸没介质的折射率的介质之间的不匹配。球面像差通常本身表现为不均匀散布在焦点沿着光轴的图像的一个点,使得显着伸长和扭曲。由于该信号被分布在一个更大的体积,其像差的存在下,信号 噪声比减少。此问题是更为严重的成像时比它是与盖玻片上的贴壁细胞(通常只有几微米厚),并可以通过使用水的浸没透镜是更密切地相匹配的折射率,在很大程度上消除了深成厚组织培养基中。作为一种替代方法,浸没介质的折射率或盖玻片的厚度可以调整。重要的是要注意,折射率随温度的变化,因此,液浸介质的最优组合,和盖玻片厚度会有所不同摄氏室温和37度之间。较新的浸渍用校正铤物镜可以用来对抗由温度引起的折射率的波动。

imaging systems figure6

 

6给出的显微镜的光学系统(面板(*))和检测器(数码相机,图(b)),在执行活细胞调查的是显着的局限性。的检体是由一个单一的间期细胞核的粘合大鼠袋鼠肾上皮细胞(PTK2线)表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的稠合的的蛋白H2B序列(其定位在细胞核中),并与外延怀德菲尔德荧光成像照明。下部的右侧角面板(一)中的光学系统,并在较低的左上角的图(b)的数字照相机系统的最高分辨率的图像。在活细胞的显微镜,光学系统确定供对比度生成,以及规定的物理分辨率的限制,它是由物镜的数值孔径和波长的照明设置的光的数量。作为照明强度的增加(运行在面板(*)从顶部到底部),光子计数噪声变得不那么明显,图像质量显着提高。同样,作为增加的光学分辨率(左面板(*)中的右边),更小的细节的细胞核变得更加显而易见。

 

数字照相机系统捕获从显微镜和数据根据离散的光水平和空间分辨率的元素(图(b),图6)的样品的光信息。像素尺寸的增加(左右图(b)),众多功能的小细节变得模糊和图像获取一个块状的,几乎不可见的外观(右下角的角落里图(b))。降低利用捕获和显示的图像(在图(b)中的顶部的底部)的灰度级的数目减少的阴影,只留下的功能具有非常高的对比度(在图(b)中的顶行)。请注意,这两个因素共同作用提供信息。再次,在活细胞成像实验,收集的信息应该是成正比的要求的调查。

 

各种滤光镜和反射镜设计的活细胞成像的显微镜直接和微调照明和发光波长的档案,因为它从光源通过显微镜(标本),然后到检测器。与对比度增强的光学系统在传输模式中,改性光组件或偏振片和棱镜(DIC)或冷凝器环空中和相位环(相衬和Hoffman调制对比度)。由于光在显微镜光学火车明场,DIC,和相衬的整体吞吐量远远高于用荧光,通常是必要的,以增加信号噪声很小的修改,当在这些模式中的成像。主要考虑的是过滤的钨卤素灯照明,以消除光毒性紫外线和红外线的波长,才损坏试样。阻止红外光,是必要的,以避免热损伤的细胞,以减少复杂的信号 噪声与红外线敏感的相机系统的背景水平。紫外线是更少的用透射光灯的关注,但使用的绿色或红色的干涉滤光器,可以容易地控制试样的波长达到。两个红外线和可见光滤光镜将显着减少光的水平,并可能需要增加曝光和增益设置的检测器系统上,以保持信号 噪声。

 

在荧光成像,干涉滤光片和二色性反射镜的组合来选择合适的波长频带的光,用于激励和收集从荧光团标记试样排放。在荧光显微镜中,相对低光照水平相比,传输模式时,呈现为实现足够的信号 噪声水平的关键的选择的滤光镜。在大多数情况下,尤其是在信号泄放通过关注的问题是由于重叠的荧光团发射的档案,带通激发和发射(阻挡层)滤光镜的应用是必需的。通常情况下,在这些滤光镜中的固有的窄的光谱窗口进一步限制通过的光量通过显微镜观察,挑战研究者用于获得良好的图像,来选择最佳带宽。

 

各种各样的具体的带通滤光镜和二色镜组合的显微镜制造商和滤光镜售后光学公司。对于最佳的信号与噪声的,选择的滤光镜的组合为活细胞成像应密切匹配的实验中所用的荧光光谱档案。例如,使用一个标准的荧光素(FITC滤光镜集的多色标记的应用程序中的图像细胞表达本身会不必要地牺牲一些YFP的荧光黄色荧光蛋白(YFP),否则将改善的信号-噪声(设计参见图7a))。在这种情况下,匹配滤光镜与适当宽的带通激发YFP的吸收和发射公司产生显着更高的信号耦合到一个长通发射滤光片。

imaging systems figure7

 

优化荧光滤光器的组合,以获得尽可能高的信号电平的一个例子,提出了在图7中的两个常用的荧光蛋白衍生物。顶部面板(图7a)和图7b))示出的吸收和发射光谱金星,位点定向诱变产物YFP,叠加超过FITC标记的滤光镜组(图7的(a)),以及一个专门的宽带组合旨在最大限度地采集的信号,在一般情况下,从黄色荧光蛋白(图7b))。虽然发射滤光镜与问候到检测器发送的信号的电平相媲美,金星的吸收光谱,和异硫氰酸荧光素的激发滤光片带通区域是显着小于宽带YFP集观察之间重叠,导致低效的激励和减少信号。同样,TRITC滤光器组合(图图7c))不激发mCherry荧光蛋白的效率作为得克萨斯红集(图图7d))。此外,在得克萨斯红组合的发射滤光镜的更宽的带宽通过更​​多的信号的检测器。关于选定的滤光镜组合应仔细检查每个活细胞成像实验中使用的荧光激发和发射,以确保最高的效率。

 

除了设计单个荧光图像的标准滤光镜的组合,多频带集现在随时提供给能够同时与两个或更多的荧光探针标记的试样的照明和探测。其他因素时,必须考虑微调显微镜的光学列车是中性密度滤镜的战略定位,激发照度水平(活细胞荧光成像的关键),以及紫外线和红外线滤光镜,以减少抵消或消除样品光毒性。这些滤光镜通常置于之间的电弧放电(或激光)的照明源和显微镜的输入光端口,并且可以很容易地互换,以优化光的吞吐量。通过显微镜的光通过的强度和数值孔径也可以通过仔细调整的冷凝器或落射照明光圈和视场光阑调节。

 

光学分辨率探测器的几何形状相匹配

只要有足够的采样由检测器系统的光学图象,在显微镜下拍摄到的图像的空间分辨率通常被定义的光学系统的分辨率。由于从每个都具有一个固定的大小的光电二极管的阵列构成的CCD探测器,几何形状的各个像素可以限制最终的分辨率的图像。为了实现大的分辨能力的显微镜,检测器的尺寸应符合每个艾里斑单元为2.53像素的奈奎斯特采样准则。作为一个例子,250纳米的光学分辨率极限,在最终图像中的像素的大小应是约80100纳米。在活细胞成像,信号噪声比光学分辨率往往是更重要的,最有用的限制收集图像没有明显的退化是每艾里斑的2个像素。减少每艾里单元的像素的数量增加的亮度的图像,并使得能够使用较大的CCD光电二极管,可以积累更多的光电子。

 

8所示的(a)是通常用在投影到CCD像素阵列的表面的活细胞成像的高数值孔径的物镜的艾里磁盘从图像。阵列中的每个像素的尺寸为6微米。的100倍的物镜,用1.4的数值孔径,将图像投影到CCD表面直径是20微米(见表1),从而容易地实现奈奎斯特采样大小(3.3像素每个艾里单元)。在本次抽查频率,留有足够的余量,几乎满足奈奎斯特准则,甚至用2×2像素组合。相比之下,60x物镜(也1.4数值孔径)的投影图像是12微米的直径,仅低于奈奎斯特限制的下边界。另外,即使减小数值孔径为1.3,在40倍的物镜产生一个8.4微米的图像,将需要一个放大镜照相机适配器符合奈奎斯特分辨率标准。光电二极管阵列具有更大或更小的像素尺寸相匹配的光学分辨率,没有中间放大的显微镜,或用专门的CCD适配器,其中包含合适的镜头系统,可以轻松地修改。

 

甲的2×2像素binning示意图在图8b)为一个包含16个像素的阵列。的光电子在曝光期间积累后,相机读出电路执行两个连续的4个象素,每个象素的平行移动。随后,两个串行寄存器位移的1个像素的地方收集的4个像素(2×2像素合并)到它们的电压的输出节点,其中读出放大器的光电子。在类似的方式中,4×4像素合并(图中未示出)将在整个16个像素阵列中的内容转移到输出节点,在读出之前,显着增加了,同时减少了读出噪声的信号。正如前面所讨论的,像素binning是一个极好的方法来检索弱信号时,检查在低表达水平降低毒性工件所需标记的荧光蛋白的活体标本。

 

在实践中,理想的像素大小在最终图像中具有的数值孔径为1.4的一个物镜是在100纳米和120纳米之间。这个数字翻译成相应的物理尺寸的CCD光电二极管,需要考虑的放大倍数为物镜。例如,为了实现为60x物镜1.4数值孔径)的完整的光学分辨率的检测器必须具有一个光电二极管6微米或更小的大小的(确定的倍率和分辨率的乘积)。然而,对于相同的数值孔径的100倍的物镜,最佳的光电二极管的大小被增加至10微米。因此,显而易见的是,仅一个特定的CCD摄像机的数字分辨率匹配的显微镜的光学分辨率,当相机被适当地联接到适当的物镜。交配的CCD照相机,具有10微米的光电二极管,以100倍的物镜,将导致在一个最终的像素大小的图像(100纳米)。相同的相机时,会产生167纳米的像素用一个60倍的物镜,这限制了在一定程度上记录的图像分辨率。与此相反,与6微米的光电二极管的CCD将被完全匹配到60x物镜,但会产生过采样的图像时,显微镜物镜转换器是旋转插入的100倍的物镜。过采样在这种方式中,将显着地降低图像的亮度的同时,不能提高分辨率。

 

从前面的讨论,它似乎唯一相匹配的检测器的像素分辨率的显微镜的光学系统的理想的解决方案是使用针对每个物镜的不同的摄像机。在实践中,很明显,这种策略是不现实的,必须找到一个妥协的单相机系统优化工具。在某些情况下,通过安装的客观时间倍率的显微镜和照相机之间的耦合器的分辨率的问题,可以规避。例如,一个0.6倍的耦合适配器将降低投影图像的倍率从100倍的物镜是相同的一个60x物镜。各种各样的耦合器提供的售后分销商增加或减少的CCD光电二极管阵列平面的投影放大。转乘半信半疑上述建议的数字CCD摄像机方面,重要的是要注意,虽然这些器件可以相对容易地从显微镜,除去它是优选离开将相机安装在显微镜的端口,以防止灰尘和碎屑进入身体的显微镜和从附着在摄像机图像的传感器窗口(静电促进的工件)。清洁传感器面板窗口是一个异常困难的任务,特别是当物镜是完全删除的每一个粒子的灰尘。

像素大小的要求比对显微镜的光学分辨率

目的
(数值孔径)

分辨率限制
(微米)

投影尺寸
(微米)

所需的像素大小
(微米)

1X0.04

6.9

6.9

3.5

2X0.06

4.6

9.2

4.6

2X0.10

2.8

5.6

2.8

4X0.10

2.8

11.2

5.6

4X0.12

2.3

9.2

4.6

4X0.20

1.4

5.6

2.8

10X0.25

1.1

11.0

5.5

10X0.30

0.92

9.2

4.6

10X0.45

0.61

6.1

3.0

20X0.40

0.69

13.8

6.9

20X0.50

0.55

11.0

5.5

20X0.75

0.37

7.4

3.7

40X0.65

0.42

16.8

8.4

40X0.75

0.37

14.8

7.4

40X0.95

0.29

11.6

5.8

40X1.00

0.28

11.2

5.6

40X1.30

0.21

8.4

4.2

60X0.80

0.34

20.4

10.2

60X0.85

0.32

19.2

9.6

60X0.95

0.29

17.4

8.7

60X1.40

0.20

12.0

6

100X0.90

0.31

31.0

15.5

100X1.25

0.22

22.0

11.0

100X1.30

0.21

21.0

10.5

100X1.40

0.20

20.0

10.0

1

 

目前的高性能数码相机系统设计的荧光显微镜光电二极管尺寸从516微米,具有片上分级。如上所讨论的,像素合并功能使从几个相邻的光电二极管的电荷被合并成一个较大的单位,有效地增加了的像素的大小。在68微米的光电二极管的尺寸范围的摄像机,充分显微镜光学分辨率通常可以被匹配使用60x物镜没有像素合并,而与100倍的物镜,以提高图像的亮度可以利用像素合并成一个2×2阵列的光电二极管。除了利用匹配的光学系统分辨率的CCD,使用更高的传输60x物镜,这种方法允许更明亮的图像时,使用100倍的物镜结合分级(2×2像素组合提高了灵敏度4倍)。其结果是,用100倍的物镜记录图像,在纸槽2是大约两倍与60x物镜没有像素合并作为记录的图像的亮(及同等或更好的分辨率)。在额外的灵敏度的情况下,需要或必要时,可以60倍的物镜分级2×2的亮度增加了四倍并发损失通常是可以接受的决议,对于大多数活细胞成像调查。

 

在一些应用中,如那些需要一个大的细胞种群的同时监测,捕获的较大部分的视野是更重要的空间分辨率。该矩形的CCD图像传感器,在数码相机中,没有中间倍率不捕获整个视场的通过显微镜目镜作为可视化的,而是它被限制为30%和80%之间的范围内,取决于芯片尺寸。是必需的,如果一个较大的视野耦合适配器(如上所述),可以采用时间倍率。在许多情况下,一个0.6倍的中继透镜将投影的图像的大小,其值接近在目镜看到的视图,但在一定的成本在分辨率。或者,为了保持分辨率,相邻的字段的多个图像可以聚集在高放大倍率使用x - Ŷ机动扫描阶段和随后缝合在一起成一个较大的图像使用采集后处理软件。

 

在光学显微镜的最大的分辨能力,实现与近紫外光,最短的有效成像波长。其次是蓝色,绿色,最后变为红色光的能力,以解决样本的详细近紫外光。在大多数情况下,显微镜使用广谱白色的光所产生的钨卤灯泡照亮标本,但在活细胞成像的照明的频谱通常仅限于通过窄带干涉滤光片的应用。在可见光光谱的中心在约550纳米,主波长为绿色光(人眼最敏感的绿色光)。它是这样的波长,被用来计算分辨率值示于表1,所以这些值将不同当利用较高或较低的波长的光时,。的数值孔径值也是重要的,更高的数值孔径也将产生更高的分辨率,可以观察到的物镜表中的类似的倍率。

 

结论

也许最关键的活细胞成像方面实现最佳平衡信号强度低倍率的青睐,分辨率(放大倍率越高,所青睐),和细胞活力的放大倍率,同时在试验过程中。调查员必须密切注意,以配合最终的像素大小的探测器,利用尽可能少的镜片的光学放大倍率。光学耦合器,具有各种各样的中间放大系数是市售匹配两个光限制和高分辨率的应用程序的特定的客观要求(倍率和数值孔径)。Nyquist分辨率标准时,应严格选择的物镜放大倍率。每个像素应该对应于不超过一半所需的分辨率的限制,由于在显微镜的衍射极限,此距离应不小于50纳米的大多数应用程序。

 

干部的活细胞成像显微镜的物镜通常采用的标准是10倍和40倍(干),以及40X60X100X的油或水浸泡版本。经济型干式低倍率的镜头主要用于标本的初步扫描,以找到感兴趣的领域和不需要的高光校正因素。然而,浸没透镜应设有高的数值孔径(1.31.45的油和水为1.2)和高的光透射效率。由于图像通常聚集的中心附近的视野,高度校正的物镜,这些物镜通常产生一个平面场提供没有可检测到的好处是明显更昂贵的和更少的光效率比少许校正物镜。用于荧光成像物镜应检查的点扩散函数使用荧光微球的质量。

 

冷却单色CCD相机是最好的选择,对于大多数成像应用领域涉及文化的活细胞,无论是否落射荧光还是透射光对比度增强(DIC和相衬)是主要的收购模式。在选择相机时,考虑的重要参数,包括量子效率,噪音水平(暗电流和读出),像素大小(以及相关的全井产能),并扫描频率。为了尽量减少水平的激发光,照射在试样上,相机应该尽可能敏感,这通常意味着量子效率高,噪声低,大的像素尺寸,和慢的扫描速率。灵敏度因此,必须对所要求的分辨率(青睐大量的更小的像素)和物镜成像率(由较高扫描频率的青睐)平衡。

 

慢扫描CCD相机一般都在他们的帧速率的限制,此外,样本,除非有非常明亮的荧光,信号 噪声比是差时的曝光时间短。这限制了使用这些摄像机系统的高速成像应用程序(高达每秒30帧),和挫败尝试聚焦样本。应努力以避免漂白和光毒性,可能会损害细胞的活力和亮度的工件,当找到一个合适的标本和对焦的摄像头。在这方面,应选择相机功能无快门,帧传输或隔行扫描CCD传感器,这是能够提供除了慢扫描数字信号的图像在视频速率的连续流。极端低光照条件下,荧光探针显示有限的丰度或低的量子产率,再加上捕捉高速运动的要求,有必要强化或电子倍增CCD相机系统使用。