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奥林巴斯显微镜:荧光显微镜优化和故障排除

2013-10-16  发布者:admin 

荧光显微镜的一个重要特点是它能够探测到荧光的对象,有时隐隐可见,甚至非常明亮与黑暗的背景(通常是黑色)。为了优化此功能,使用的引物在该部分将要讨论的原则,图像的亮度和分辨率必须最大化。

 

图像亮度 - 优化的图像的亮度的最重要的方面之一是,以确保在每个连接到试样的发色基团的适当的波长,样品被提供用于激励具有足够的光能量。同样重要的是,选择适当的挡板滤光镜,向观察管或摄像管发射的荧光的量最大化。我们已经组建了一个表列出的荧光激发和发射数据,这将有助于实现这一物镜。高能量的光源,如汞和氙气的燃烧器,将提供大量的激发能在非常窄的范围的近紫外和可见光。当使用这些光源耦合到同时阻挡那些是不希望的,能够发送所选波长的激发滤光镜,适当地选择,然后将满足用于激发的最佳标准。

 

挡板滤光镜,防止不需要的波长进入观察管的选择是一个主要问题。激发的总能量是远远大于发射的能量,因此,重要的是要选择一个有效的挡板滤光镜,将阻止不必要的波长荧光发射,同时允许从样品通过。为荧光选择的物镜必须能够有效地透射光,在近紫外区域和在整个可见光谱。

在低发射的光水平的图,在荧光显微镜中的作用的物镜是非常重要的,因为它是收集来自样本的光的物镜的功能。物镜所接受的光的锥角是由数值孔径(NA)为物镜来确定,如在图1中示出。在透射光中的荧光显微镜,到达眼睛或其它检测器的光的强度成正比作为物镜聚光镜的总放大倍数的平方成反比的数值孔径的平方。

 

numaper

 

另一方面,在反射光荧光的图像的强度变化直接作为使用中的数值孔径的四次幂物镜,以及数值的总放大倍数的平方成反比:

 

I = NA4 / Mag2 

 

这种差异来作为物镜的最初功能作为一个聚光镜,用于在样本上的光聚光,然后作为用于图像形成的通常的光采集的结果。其意义是显而易见的:高数值孔径物镜会产生高得多的强度比相同的放大倍数较低的数值孔径的物镜图像。例如,其他的事情都是平等的,40倍物镜的NA为1.0将带来超过5倍的亮度比40倍物镜的数值孔径为0.65的图像。进一步的含义是,如果可能的话,低倍率的视觉目镜(如8倍的放大倍率)也将增加图像的亮度相比,比较常用的10X观察目镜。此外,在反射光中的荧光,激发光被浓缩的物镜(在其作为聚光镜的功能),仅在被观察的区域。其结果的激励光的强度远高于在透射光中的暗视野荧光,其中被激发的面积不改变作为物镜被改变。此外,在暗视野,物镜的数值孔径必须被减小到低于保存的视场的黑暗的聚光镜

 

除了是一个重要的考虑因素的数值孔径,这是可取的有最高质量的色差校正的物镜,因为聚焦在同一平面上的各种颜色,将产生更清晰的图像。另外,更好的球面校正,更清晰的图像。因此中,物镜的选择是平场复消色差物镜平场荧光物镜。的设计应使这些透镜元件及其水泥本身不会自动荧光时,低于400纳米的波长(光在近紫外)光照射。

 

在可能的情况下,应采用油浸物镜,从载玻片和盖玻片表面反射所造成的光损失减少到最小。现代显微镜制造商努力为客户提供光学元件是完全免费的自体荧光污染物,但是这方面也应考虑自体荧光将减少通过增加背景亮度对比样品。

 

图像分辨率 - 皇家显微学会(RMS)标准盖玻片厚度如果0.17毫米。中的统计抽样,由于在制造过程中的波动的盖玻片这个号码(通常0.01毫米0.03毫米)的有一种轻微的变化程度。高数值孔径“干”的物镜是最容易受到这些变化,许多人提供校正衣领,让显微镜微调物镜校正玻璃盖厚度。这是非常重要的,购买高度精确的盖玻片,确保物镜校正衣领优化调整。此外,一些厂商提供专业化的物镜,包含一个内部的虹膜式光圈与100X复消色差透镜奥林巴斯物镜如图2所示。应尽量减少眩光的这个可变光阑(图2)进行适当的调整,如果配备的话,在使用的物镜。

 

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当使用油浸物镜,吸干镜头前用纸巾除去油使用后,确保清洁定期用适当的溶剂(通常约一个月一次就足够了)。多余的油留在浸泡物镜可以拿起空气中的灰尘,并降低图像质量和分辨率。此外,还要确保浸油,无PCB,有一个非常低的或不存在的电平的自体荧光,被施加到没有形成气泡的物镜盖玻片界面。

显微镜的光路中应仔细调整,以确保所有组件都已正确放置并执行,它们被设计。应正确对准光源的电弧光源为我们的讨论中所描述的荧光显微镜。

 

清洁光学元件 - 在荧光显微镜(和所有其他形式的显微镜)的第一条规则是要保持完全免费的灰尘,污垢,油,溶剂和任何其他污染物的光学元件。显微镜时,应保持在低振动无烟房,是尽可能干净,并具有循环空气的干扰最小。使用防尘盖显微镜在不使用时,保持在气密容器内的所有配件。避免使用腐蚀性溶剂来清洁显微镜的任何部分,并且只能使用稀释过的肥皂水清洗非光学表面。物镜应保持清洁使用下面的提示:

 

•切勿拖动任何具有高度的压力,包括镜头纸在镜头表面,以避免表面上的可能性非常细微的划痕引入。
•用溶剂设计的光学表面,或在紧急情况下,无水乙醇清洁镜头。避免其他溶剂,因为它们可能与光学镀膜玻璃上反应。
•灰尘在镜头表面前压缩气体用溶剂清洗,以去除松散颗粒。
•浸泡棉条镜头清洁剂或酒精轻轻擦拭它在镜头转动棉签头几次,每次传球前。用镜头纸吸干多余的溶剂,并让镜头彻底晾干。重复此过程。

 

油浸镜头可以用溶剂清洗,如上面所述。切勿使用油与物镜拟用于干燥,因为清洁干燥的物镜困难得多一个专为油。

 

进一步提示和故障排除 - 在理想情况下,所有应做显微镜在黑暗的房间,但荧光显微镜,这一点尤其重要。人类的眼睛有问题,迅速调整到天黑,这将是很难辨别一个非常暗淡的荧光标本后立即变黑房间。通过阻断激发光时,不观看或摄影标本,避免过度漂白的标本。尽量减少自体荧光去除多余的荧光在安装前彻底清洗试样。对于其他方面的一般问题的解决和故障排除,请参阅下面的表1。

 

问题

原因 

纠正

光学系统

 

 

灯泡打开,但不能看到图像或者是黑暗的。

关闭快门旋钮,或ND滤光器在使用中。

将快门打开光圈卸下ND滤光镜

 

立方体旋转到正确的光路

立方体旋转到正确的光路

 

激发滤光镜和挡板滤光镜的正确结合。

按照荧光染料组合滤光镜。

 

孔径光阑视场光阑或物镜的光圈开口没有完全打开。

孔径光阑和物镜的光圈开口完全打开,并打开视场光阑开口,直到其图像包围的视野。

 

标本立方体不适合使用。

更改到一个合适的立方体

图像不清,视力模糊或有足够的对比度。

物镜滤光镜脏了。

擦拭它们,保持清洁。

 

激发滤光镜和挡板滤光镜的正确结合。

按照荧光染料组合滤光镜。

 

孔径光阑或视场光阑开不正确打开。

孔径光阑完全打开,并打开视场光阑,直到其图像包围的视野。

 

标本立方体不适合使用。

更改到一个合适的立方体

部分图像模糊或不均匀的照明。

不正确地插入到光路中的物镜

旋转物镜转换器,直到它卡嗒一声响。

 

立方体不是旋转而成的光路正确。

旋转该立方体到光路径正确。

 

视场光阑开放是过于封闭。

打开视场光阑

 

光闸滑块推远远不够。汞的燃烧器没有正确居中,或聚焦调整尚未完成。

按下光闸滑块的方式中心汞燃烧器或调整的重点。

过度的刺目。

激发滤光镜挡板滤光镜未插入。

插入所需的滤光镜

电气系统

 

 

电源开关指示灯不亮。

电源线连接不正确。

正确连接。

电源开关指示灯会亮起,但汞燃烧器不会。

连接器连接不正确。燃烧器尚未安装。

正确连接安装燃烧器。

 

在灯壳体联锁操作。

灯泡插座锁定螺丝拧紧牢固。

 

自动燃烧器不工作。

关闭电源的电源单元。再次开启。 (重复是必要的。)

灯泡闪烁,或者是黑暗的。

没有足够的时间已经过去了,因为燃烧器被打开。

等待10分钟后打开燃烧器。

 

灯泡的使用寿命已到期。

更换汞燃烧器,生命表的读数如果超过200小时(灯寿命介于100和300小时)。

 1

 

显微摄影的荧光标本,提出了一些独特的挑战,是无与伦比的光学显微镜。虽然相机系统参数保持不变,必须支付更多的关注,暴露的细节和这些文物互惠故障发生的结果非常长的曝光时间。有许多好书的主题,有兴趣的读者被称为我们的参考书目和网络资源的进一步信息部分。



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