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尼康显微镜:尼康衍射效率增强系统(DEES)

2013-10-16  发布者:admin 

在尼康的A1si的共聚焦显微镜,荧光发射光进入探测器首先通过一个专有的衍射效率增强系统(简称DEES),分离为两个正交的偏振光的波阵面(称为ps)进入的非偏振光的发光,使用偏振分光镜。DEES系统的目的是为了增加光的衍射效率由光栅用于分离成不同波长的荧光发射。离开分束器后,在p-波阵面是旋转90度(成s偏振光的波),使用棱镜系统和两个光束然后由三个可互换的光栅衍射。衍射光栅,可以精确地控制,以确保高度的重现性,波长分辨率为2.5,6,和10纳米。

  

本教程2.5纳米的衍射光栅安装在光栅轮,传入的非偏振光通过通过DEES极化单元初始化。偏振光衍射光栅的32通道光电倍增管由两个反射镜,每个波束上独立地操作,但收敛的光电检测器上。直接,DEES配置以上示意图光谱的增强型黄色荧光蛋白(EYFP)在全分辨率取决于衍射光栅的波长增量由仪器检测。为了操作教程,使用按钮选择一个衍射光栅和观察EYFP频谱检测带宽的变化。Zoom按钮穿过分光镜和偏振旋转器移动的波前产生的特写视图。 

 

最通用的光谱成像的共聚焦显微镜配置,可以极大地提高采集速度收集的lambda栈,利用多通道光电倍增管收集后,用衍射光栅分散的有限波长的荧光发射带。此次收购战略已经成功地实施,在尼康C1si和A1共聚焦显微镜,每一个都能够高速只有一个单一的扫描光谱采集。多通道光电倍增管(通常称为多阳极的光电倍增管),在这些仪器中包含的一个线性阵列个别10纳米检测通道内置到一个单一的单元,从而使要成像的多个发射带平行,从而严重地限制了试样的光漂白和光毒性。尼康光谱检测单元设有采样增量2.5,5(或6),和10纳米,可以是单独的光路调整的频谱带宽的lambda部分旋转到的几个的衍射光栅。分散的排放,然后通过精确定义的渠道多阳极光电倍增管的32通道,每个通道生成一个单独的图像。总的荧光发射带宽取决于由衍射光栅采样增量:2.5纳米的抽样产生的80纳米的带宽,5纳米光栅产生一个160纳米的带宽,而6纳米光栅产生192纳米的带宽和10纳米光栅产生一个320纳米带。尼康文书,光谱成像检测器使用的激光屏蔽机制,消除从激励源的激光反射光,和衍射光栅可以倾斜,选择进行了子采样的任何带宽。 

 

nikon dees java figure1

  

其中高性能成像光谱共焦显微镜的先进功能尼康独特的专有衍射效率增强系统(DEES),这是设计,消除两极分化文物,光栅波长减少损失,并捕捉荧光发射的最大金额。DEES系统操作通过双偏振分束器的光学元件,以产生双组分称为ps的波阵面取向平行和垂直于入射面,分别通过非偏振的荧光发射。最精通的衍射效率与s偏振光被观察到,因此被定位在通路的p偏振光的光而产生的s偏振光的偏振旋转器,光栅系统的效率显着提高。正如图1(a)中所示,p偏振光的衍射效率是450至675纳米的波长范围内的90%以上。与此相反,s偏振光的效率是80%,在450纳米和几乎呈线性下降到约45%,在675纳米。因此,尼康DEES系统可以显着提高光的通过,因此,灵敏度,在光谱检测单元。的频谱宽度的情况下,必须进行调整,可以进行额外的试样扫描相邻探测器通道可以组合(称为分级),双,三,或四重检测频带的宽度。

虽然基于狭缝的光谱成像的共焦工具能够在高分辨率成像的发射光谱,它们的速度相对较慢时相比,装有与多阳极光电倍增管的显微镜。即使是那些工具的功能镜像狭缝部分的带宽,以反映第二或第三倍增仍然遭受缺乏成像速度为活细胞成像所需的时间尺度。在许多情况下,超过200纳米的狭缝系统测量频谱可能需要几分钟或更长时间,从而阻碍了光谱成像的标本,在整个拍摄期间,经过时间的运动。光谱成像显微镜的性能,先进的功能,提高灵敏度校正在基于多阳极显微镜(参见图1(b))。这些工具使用的基础上可溯源的光源的发射线和亮度调整每个通道的波长精度校正。此外,光纤元件的端部和检测器的表面都涂有一种特有的防反射剂,以减少信号的损失,并实现高的光传输。最后,先进的双积分信号处理(DISP)技术已被添加到图像处理电路,以提高电效率,防止信号损失,同时数字化器处理的像素数据和复位。其结果,该信号被监测整个像素的驻留时间,从而显着改善的信号 - 噪声比。事实上,这些技术相结合使32通道光谱成像(512×512像素)每秒24帧的速度足够快,为各种各样的活细胞成像应用。