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尼康显微镜:完美的对焦系统(PFS)

2013-10-16  发布者:admin 

目前在荧光蛋白技术革命驱动广泛的相关联的方法,包括使用的活细胞在荧光显微镜的各种摄像模式。在过去的几年中,由于丰富的动态信息,它可以提供有关细胞功能的基本性质,在许多细胞生物学实验室的活细胞成像已经成为一个必不可少的工具。也许最有趣的生物学问题,包括那些关于增长,分化,分裂和细胞凋亡的可视化在活细胞中,最终将被回答了长期的显微镜使用时间推移成像技术的调查。活细胞成像,其中的细胞必须保持在一个健康的环境,在显微镜舞台上,提出了一系列的挑战,以确保细胞维持生命,在整个试验过程中关注的焦点。本发明提供的环境条件是理想的,最显着的陷阱成像活细胞是固有的焦点漂移,经常发生由于热梯度,振动,机械不稳定性,以及一些其他因素。

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通过创建一个唯一的硬件解决方案,尼康已经解决了这个问题的焦点漂移,被称为完美的对焦系统(PFS),其目的是打击轴向重点长期影像学检查过程中实时波动。广泛的干,水和油浸物镜,从4倍到100倍具有不同的数值孔径和工作距离,可以使用TIE-PFS倒置显微镜聚焦补偿。被容纳在一个专门的的物镜转盘单元(图1),并不需要额外的的无边空间和使主显微镜光学火车保持专用于成像的近红外870-纳米LEDCCD行传感器,利用由PFS。其中最先进的功能的尼康PFS5毫秒(200赫兹)的采样率,这是独立的显微镜和相机控制软件,并大大快于其他系统的的盖玻片接口到焦平面的利益都必须反复探讨。利用长波长的LED,使铁PFS使用了大量的各种荧光基团发射的波长范围在340750纳米之间。此外,PFS可用于几乎所有的对比增强成像模式,包括明场,暗场,相衬,霍夫曼调制对比度,DIC,宽视场荧光,激光共聚焦,TIRFM,旋转盘,和扫描线扫过场。

 

PFS的多功能性是显而易见的,从范围广泛的荧光探针,可用于活细胞成像焦点漂移补偿。如上所讨论的,在PFS单元的带通干涉滤光器跨越宽的传输范围中的340750纳米(见图2;左红色曲线),使应用程序的所有公知的荧光蛋白质(包括发射近红外植物光素),量子点,和最流行的合成的荧光团(范围从Fura-2Cy5标记的Alexa Fluor700,并且最在ATTO染料)。该系统还采用了用于透射(透射光)的细胞培养的照明使用上面列出的传统的对比度增强技术的红外截止滤光器。通过除去从PFS单元内部的红外阻挡滤波器,它可以适合于用激光镊子和激光俘获应用程序,以及作为一个部分的多光子激发光谱区域。滤波器的通带为可见光和近红外区域的PFS系统(红色曲线;870纳米LED)和其他的重点补偿系统(蓝色曲线约780纳米LED),如图2所示。请注意,在加油站的较长波长的LED能够使用的荧光团发射的波长处,在其他系统中的冲突的焦点检测。广泛的物镜(超过50种)兼容的PFS单元包括油和水的浸泡,干许多不同的设计和修正的物镜,相衬物镜,有长工作距离的几个可选的物镜

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在除了加油站所提供的宽的荧光基团的发光波长范围,高的聚焦校正的采样率是至关重要的实验,需要在实时速度或更快的成像。许多市售的聚焦补偿系统调整焦点之前触发图像捕获软件,这严重限制了可用的在收集连续图像之间的最小时间间隔。例如,当在5秒每帧的成像,大多数焦点漂移补偿系统就足够了。然而,一个系统,需要500毫秒的时间来采样的聚焦状态将限制图像采集速度几乎是第二个(或更多),根据摄像机的积分时间。这将创建一个巨大的瓶颈,对于许多应用程序在活细胞成像。通过解偶联重点从图像采集取样,PFS连续的图像采集速度范围从几毫秒到分钟不中断。事实上,捕捉速度是有限的一体化摄像机的时间,而不是集中位置采样。连续采样功能是非常有用的监测实验,在高速的几个横向切片位置(需要XY载物台的翻译),调查(如使用荧光蛋白的生物传感器监测钙波感应),要求迅速加入试剂的切片室在一个实验的过程中,只有几毫秒的持续期间。

 

完美的对焦系统剖析

关键的基本概念尼康PFS是一个合适的轴向(z)的参考平面,可以被用来建立一个确切的近端之间的关系的物镜前透镜元件的位置和感兴趣的焦平面内的切片,准确地检测。完成该任务使用的近红外光(870纳米),所产生的辅助的光学系统,和引入主显微镜光学列车通过二色镜。在870纳米的光,这不会干扰正常的透射光或荧光观察,由物镜聚焦到驻留之间的盖玻片(折射率1.5)和周围介质的试验片(折射率的折射率边界,1.33-1 .38)时使用油浸泡的物镜。水的折射率边界作为参考平面,当浸泡水或油的物镜,但干物镜使用空气玻璃盖玻片上面临的物镜前透镜元件的相对侧上的边界。

 

在操作中,研究者专注于感兴趣的平面内的检体(通常的生活,贴壁细胞的培养,在一个专门设计的成像室)和激活的PFS单元,然后投影到参考平面和所述近红外线图案定义了一个偏移量或轴向参考平面之间的距离和切片焦平面。 PFS的连续位置数据馈送回的电路控制的显微镜聚焦机构保持在参考平面和成像焦点之间的精确关系。偏移的程度是由操作员控制,并且是由一个步进电机(0.025微米的轴向分辨率)的PFS单元中保持恒定,不论独立的垂直波动发生的检体的位置或显微镜光学列车。线性编码器的寄存器的位置坐标的物镜类型的一个函数的物镜转盘,并用来作为一个计量装置,以确定位置的物镜有关的参考平面。因此,物镜转换盘的轴向位置和焦点偏移量可以被注册和存储每个物镜与线性编码器的电子控制装置。

 

尼康PFS单元被安置在六个物镜机动定位之间的荧光过滤器设置炮塔和舞台上倒模型Ti-E显微镜的物镜转换器。为系统的电子控制器被集成在该帧之内,所以本机工作在独立模式下,而不需要一个软件接口到主机计算机。完美的对焦,使用杠杆的住房摆动二色镜流入或流出的主要眼镜直通车在平行光区域的波下的物镜,可以从事或脱离。公司内的PFS单元是一个单独的光学系统,包含偏移的透镜,光束成形光学元件,近红外870纳米的光的发光二极管,和一个线CCD探测器。为LED的光源和检测器的单独的光学列车在半透半反镜的中央部的单元相交,并从主使用可切换的主要的二色镜的光学系统的近红外光被引导和检索。的PFS的一个独特的特点是,形成的图像和聚焦检测系统共享相同的光学火车的一部分,但可以彼此独立地运行没有在它们的光谱的组合物的差异所造成的干扰。

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示于图3是一个示意图,示出在主(成像成形;黄色光线跟踪)和焦点检测(红色射线的痕迹)所使用的光学系统来监视和维护焦点。第一,由LED发射的近红外光通过聚光透镜和狭缝板(具有的长轴垂直于页面),共用一个共轭平面的玻璃液界面在盖玻片。准直透镜的狭缝状的光转换成平行束,并将其传递通过一个半月形瞳孔限制掩模块沿光轴的中央区域的光的一部分。然后,该光束被透射穿过半反射镜,它也用作到检测器上的光学列车的交点。第一,通过半透半反镜透射的光聚焦偏移的调整透镜系统,然后直接通过之前进入主显微镜的光学系统的交点的PFS单元作为通过二色镜的可见光截止滤光器。

 

交叉的二色镜(物镜下方的定位),它反映的近红外光,并通过可见光,是一个主要组成部分的远焦无穷大的空间(平行光的波阵面)的图像形成,并集中检测光学系统。从PFS单元的近红外光进入主光学系统从反射镜表面反射后,通过物镜聚焦到所述切片腔室。请注意,物镜还操作以同时点亮(在荧光模式下),并接收从检体的图像形成的波前。正如在图3中示出的光学系统,图像形成组件包括物镜,各种二色镜和过滤器,管透镜,相机中继透镜,和主CCD图像检测传感器(表示在黄色射线痕迹)。的红外截止滤光器可以被放置在主光火车之间的PFS交集和相机系统,以确保从聚焦检测单元的近红外光的杂散不干扰图像形成。

 

3中描绘的可见和红外截止滤波器用于清洗污染的彼此的光的各自的光学系统(摄像和PFS)。因此,可见光截止滤光器(放置在入口处的PFS光学火车)确保荧光发射和传输宽带可见光辐射不输入PFS光学系统和扰乱线传感器或LED光源。同样地,位于下方的交叉的二色镜的红外截止滤波器用于去除PFS-产生的光进入光学列车的摄像部,并创建由图像传感器,可以检测到的噪声。因此,这两个独立光学系统共享只有一小部分的整体成像光学列车,包括交叉的二色镜,物镜,与切片腔室。否则,该光学系统是能够共存,并独立运作。

 

线状PFS的近红外光从玻璃的切片腔室中的水界面反射的光束通过物镜被捕获,并转换成在主显微镜的光学系统的平行波前。该光被反射回到聚焦探测光学列车二色镜相交,并再次穿过前的可见光截止滤光器和偏置调整透镜组件被反射到图像形成PFS由半透半反镜的检测用的列车。进入后的PFS的检测系统,其中包含一个冷凝(物镜)的透镜,两个中继透镜,一个半月形掩模,柱面透镜,和一个线CCD探测器中,光被转换成一个图像的狭缝由聚光镜头。狭缝图像,然后通过中继透镜和半月形掩模之前,进入圆筒形的线整形透镜被投影到的表面上的线CCD传感器。请注意,在检测光学列车半月形掩模的光屏蔽对应的PFS光学系统的LED部分由类似的掩模的相同的区域被屏蔽。一圆柱形透镜压缩和形状的狭缝图像,以便它形成了一个清晰的线的中央部的CCD。的PFS系统使用形状的圆形光束,以减少与检测的玻璃液界面的散射和其他构件,而不是由狭缝的光。

 

PFS单元的一个关键部件是偏置调整透镜系统,它位于之间的半反射镜和第一二色镜,并与在图4中的示意图概述。由于其定位,偏移的透镜系统,由两个LED狭缝照明和线CCD图像形成光学列车的PFS共享。的偏移量的系统运行转移的PFS狭缝图像的焦点位置在和谐与一个电子反馈循环,该循环控制显微镜轴向(z)的位置,从而使该系统创建的检体和玻璃 水界面的完全独立的焦平面。检体图像平面被定向到检测器或目镜,通过两个独立的光学系统的狭缝图像被定向到的PFS线CCD探测器。

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在图4a)中,提出的缩写版本的光学列车含有只把偏移透镜和主显微镜物镜,以及检体和盖玻片,为了简洁起见,说明。此外,图例介绍了参考平面的盖玻片的下表面上的空气 玻璃界面驻留在用于干物镜的情况。黄色射线痕迹指的图像形成的主显微镜的光学系统的光波。黄色的光线不通过的PFS光学列车由于限制上述​​二色镜,它指示这些图像形成的波阵面的目镜或其他探测器。红色射线的痕迹纲要重点检测光波和的PFS单位收集。的偏移量的透镜组件被称为为转台透镜和在图4中的偏移量的透镜。这些透镜移位的PFS生成的狭缝图像,这是预计到盖玻片接口,来回沿着光轴,他们也同时移动的反射图像向上或向下跨线CCD探测器的像素。的偏移量的系统的设计,以使操作者选择的区域的切片物镜的焦平面重合,同时保持固定的距离的物镜前透镜元件和切片盖玻片之间使用PFS漂移校正硬件。

 

偏移量的系统炮塔透镜被固定在光轴上(并入多透镜刀架),而偏移镜头本身允许沿着光轴来回转换的狭缝图像的位置移动。的PFS单元初始化后,物镜的焦点(F)和的的PFS狭缝图像(A)在盖玻片和介质浴的切片(图图4a))之间的界面区重合。这种情况被称为零点偏移。为了引入物镜焦平面和狭缝参考平面的偏移量之间的距离,操作员可以打开的PFS偏移控制器拨号搬迁的偏移量的透镜,从而狭缝图像的焦点。在图4b)图中,透镜被移动的距离为x,这导致在一个移位的狭缝图像焦点A到一个新的位置更接近物镜。因为偏移的透镜具有的物镜的图像形成的光波​​(焦点F)的焦点上没有影响,正在两个焦点在相对于彼此偏移。一旦PFS反馈回路调整搬迁狭缝像焦点在盖玻片界面(图图4c))的点(A)的物镜位置,物镜焦点(F),然后移动到切片的中央部。在操作者的便利性的距离可以改变之间的焦点FA的偏移量,以及被称为探测切片中的各种深度。

 

可与PFS单元的偏移量的范围是由所使用的类型的物镜,但通常从盖玻片上接口(零毫米)范围内,以最大的油浸物镜大约为10微米,20微米的水浸泡的物镜,以及高达至100微米或以上的干性的物镜。需要注意的偏移范围内降低物镜的工作距离,因此具有高数值孔径的油浸物镜,具有很浅的震源深度的限制值。成功能够监视的z参考平面的轴向位置的其中一个最重要的方面,是近红外光在界面处反射的光束的信号强度。使用浸油的物镜时,油和盖玻片玻璃之间的界面处的狭缝图像的反射率是有效的零,因此不会干扰聚焦控制。随着水浸泡的物镜,在此界面处的反射率的值等于界面(在切片上侧)的上部的盖玻片上,但这些高倍率和数值孔径物镜的焦点深度浅,确保不会干扰与PFS控制下反射功能。相反,对于干燥的物镜,盖玻片 空气界面处的反射率是10倍大于在切片盖玻片界面,所以前者接口被用作用于聚焦控制的基准边界。到光路中引入适当的炮塔透镜可用使用宽范围的物镜所需的偏移量的差异可以通过以下方式获得。

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在操作期间,控制的物镜位置,并反过来,焦平面成像的检体和PFS狭缝(在图4中的AF,分别),是由线CCD传感器上的狭缝图像的投影PFS单元,如图5所示。切片摄像室(参考接口)的情况下,在负的轴向方向(-z)的偏移,偏移沿的CCD的像素行的一端的狭缝图像和扩大。发生的反向时,腔室中的正方向(远离物镜偏移;+ z)在显微镜光轴。一旦发生移位的PFS控制器移动的物镜,在补偿的方向恢复的狭缝图像的中心的线CCD传感器。图5示出了作为焦点位置的函数,(z)的线CCD传感器上的狭缝图像的信号强度。当PFS狭缝光被直接聚焦在参考平面上,狭缝图像重叠线CCD(图5a))的中央部。通过在正的轴向方向上的距离越来越大,作为基准平面的位移的狭缝图像的扩大和移向的线CCD的边缘(图5b)至图5d))。在负的轴向方向移动时发生的反向参考平面。

 

线CCD探测器的PFS系统中是一个关键因素,因为来自狭缝图像投影到CCD表面的信号被直接馈送到控制电子装置的CPU中的单元,它解释焦点信息来确定的聚焦状态收纳相对于参考平面的物镜。 PFS电子必要的信息,然后输出到正确的位置,带动物镜转换器的线性编码器控制单元(装在显微镜帧)。与加油站所用的每一个不同的物镜登记的控制电子装置提供的数据,可以使用以建立正确的物镜转盘位置有关的物镜前透镜单元。 PFS单元被激活时,鼻夹的物镜驱动的注册的垂直位置,然后接近一半的工作距离(约65微米的值对于一个典型的100倍复消色差物镜)的切片腔室。在这一点上,所述参考平面(称为狩猎)的PFS单元搜索,直到它检测到由线的CCD。在不能检测到的情况下的参考平面,在搜索操作停止后一个预定义的时间内。过度狩猎当被使用或不正确的浸油,如果检体参数不符合要求的PFS单元可以是一个问题,这两个条件,导致线CCD的信号检测差。这是重要的,以确保有足够的水溶液(培养基),洗澡的检体或完全失败检测的接口也可以发生。在理想的情况下,对焦精度的PFS一般不少于三分之一的物镜,震源深度。

 

PFS单元的设计主要是安置在专门的成像室配备盖玻片在厚度范围从150180微米(第1或第1.5盖玻片)的图像活细胞。其他切片可能要困难得多观察焦点漂移校正由于弱的红外线反射率或过度的散射光。这些包括高折射率介质(更密切地相匹配的盖玻片)中所装的固定切片。在这种情况下,从聚焦监测系统的反射光的量可能不足以检测的接口表面。同样,厚组织切片,其中散布了大量的光,是难以用焦点漂移校正。厚的玻璃盖玻片(大于180微米)或塑料组织培养皿不推荐,因为可能无法检测到的边界表面由于没有足够的偏移。最后,盖玻片表面上的灰尘和碎屑可以降解的边界检测的精度,导致过度狩猎或焦点校正的错误。

 

结论
虽然有几个商业上可用的基于硬件的焦点漂移校正系统在市场上,一切都是为了测量反射率从盖玻片为基础,其操作界面。主要发生分歧的方式将每个单元完成这个任务,而这些变量有显着影响单位可以成功地检测出重点和捕捉图像的速度。另一个主要的不同之处在于在复杂的例程,需要在一个实验中,在不同的横向和轴向位置的捕获图像中的各种系统的能力来处理成像。重点检测,近红外光的尼康PFS单位在不影响大多数形式的发送和荧光显微镜和不漂白或光毒性。切片中的焦点位置的控制由操作者使用的偏移量的功能,可以将焦点保持任何在viewfield位置。与几乎所有的科学级CCD或电子倍增CCD摄像系统和用于成像的对比度增强技术在各种各样的聚焦控制,可以实现与PFS。在其中PFS是不需要的情况下,交叉的二色镜可以容易地从摄像光学路径中移除,以提高光的吞吐量。当连接到适当的环境室和恒温控制系统,尼康的PFS系统是能够提供前所未有的精确度,在保持合适的切片中大家关注的焦点,在整个成像会议。