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奥林巴斯显微镜:浸入介质

2013-10-16  发布者:admin 

捕捉偏离光线从标本的显微镜物镜的能力取决于两者的数值孔径和介质,通过它的光的行进

immersion

数值孔径的有关通过方程的成像介质:

数值孔径(NA= Nsin µ

 

其中μ是一个一半的孔径角的物镜 n是物镜前透镜和标本盖玻片之间的介质的折射率。

 

如明显的数值孔径方程上述,一个物镜数值孔径是成正比的折光指数(n)的在成像介质的盖玻片和前透镜之间,并且也1的一半的角孔径的的罪物镜。因为罪恶μ可以不大于90度时,可能的最大数值孔径的浸没介质的折射率确定。大多数显微镜的物镜使用空气作为媒介,通过它的光线必须通过保护标本和前面的镜头物镜之间的盖玻片。这种类型的物镜被称为作为干的物镜,因为它们是不使用液体的成像介质。空气的折射率为1.0003,非常接近真空,并大大低于大多数液体,包括水组(n =1.33),甘油组(n =1.470)和常见的显微镜浸油(平均n=1.515)。在实践中,被限制的干燥物镜系统的最大数值孔径为0.95,和更大的值只能使用用于浸渍介质的光学设计来实现。

浸油的原则,表现在图1中,其中个别的光线追踪的样本,然后通入的物镜,或在其他方向上折射。图1a)示出的情况下,干燥的物镜5条(标记为15)示出通过一个示例,用盖玻片覆盖。这些光线被折射在盖玻片 空气界面,只有最接近于光轴(光线12)的显微镜两条射线进入物镜前透镜的适当的角度。第三射线盖玻片约30度的角度的折射,而不会进入的物镜。最后两个射线(45)在内部通过盖玻片反射回来,并沿与第三射线,有助于在倾向于降级的图像分辨率的玻璃表面的光的内部反射。当空气被取代油的玻璃,在图1b)所示的相同的折射率,光线现在通过直通玻璃 油界面无偏差由于折射。因此,数值孔径的增加,油的折射率为n的因子。

 

设计用于浸油的显微镜物镜有许多优于那些用于干燥。浸没的物镜通常是较高的校正(无论是荧光或复消色差的),并可以有工作的数值孔径为1.40时,使用具有适当的分散性和粘度的浸油。这些物镜允许台下聚光隔膜被打开至更大的程度,从而延长照明的标本和利用的增加数值孔径。

 

一个经常被忽视的因素,增加数值孔径时使用油浸物镜是放在台下聚光系统的限制。在油浸物镜的NA=1.40的情况下,正被用于图像台下聚光器的较小的数值孔径(例如1.0)的标本具有较低的数值孔径的聚光镜覆盖的总的物镜NA的系统被限制到1.0,在聚光镜的数值孔径。

 

现代台下聚光镜往往具有高的数值孔径在1.01.40之间的范围内的值的校正程度(见我们对聚光镜的部分)与。为了有效地利用浸油的所有好处,台下聚光前透镜和包含标本的显微镜载玻片的底面之间的界面时,也应浸在油中。一个理想的系统的示意性框图在图2中,已放置在浸油物镜前透镜和标本之间的接口,并在聚光镜前面的镜头和底面样本载玻片之间。

total oil

 

该系统被称为齐次的沉浸式系统,它是理想的情况下实现最大数值孔径,并在光学显微镜的分辨率。在这种情况下,物镜前透镜,浸油,台下聚光前镜头,和安装介质的折射率和分散体是相等的或非常接近相等。在这种理想的系统中,可以通过一个倾斜的光通过聚光透镜,并完全通过显微镜载玻片,浸油,和安装介质油玻璃或安装介质玻璃接口通过折射不偏执

 

当使用高倍率的消色差透镜油浸物镜时,它有时是允许省略上油聚光镜顶部透镜的步骤。这是因为聚光镜孔径光阑必须经常与较小的校正物镜减少消除工件,并提供最佳的成像。膜片尺寸的减少,减少的潜在增加数值孔径的(上油聚光透镜设置),因此在这些条件下,通常是在图像质量的损失可以忽略不计。

 

有已设计优化浸没显微镜技术各种市售的合成油。许多国家纷纷发表自己的标准的必要的素质,浸油和国际标准组织已经认识到了ISO8036标准的光学性能通用的浸油:

 

N E = 1.5180±0.0005(D = 1.515
V E = 44±3(阿贝数-扩散指标)
•温度为23±0.1摄氏度

 

除了严格控制的光学性质,浸油还必须表现出合适的物理化学特性,如非干燥的,惰性的光学表面的涂层,非荧光,化学惰性的,无毒的,并易于除去。大多数显微镜制造是专门匹配的物镜色散特性,用自己的物镜提供一个专门的浸油。请确定您所购买的售后油相匹配的物镜,油的物镜是满足分散条件。许多旧的商业化生产浸入油(特别是超过10年前制造的)显着量的多氯联苯。这些油是致癌物质,应避免使用,但大多数较新的浸泡油是在没有这种危险的化学品和使用是绝对安全的。浸油介质的主要制造商为Cargille Laboratories, Inc., Cedar Grove新泽西生产的油五种标准类型:

 

普通光学显微镜 最常见的浸油的会议分成两个粘度要求(A型和B):1501250厘沲。这些油可以混合生成中间产物的粘度。


高粘度油(NVH)型 - 具有粘度为21000厘沲,这种油倒,水平和倾斜的应用程序和极长的工作距离物镜标本,利用广泛的聚光镜差距,也为流行。


荧光显微镜(DF型) - 油产生荧光显微镜的最高分辨率。这种油产生的背景色是浅绿色的。


荧光显微镜(FF型) - 改进的油,基本上没有背景荧光,是清晰的,非吸湿性。该油通常被称为通用油,因为它可以取代的几乎任何其他荧光应用浸油的信心。

1列出的cargille实验室浸泡油最常见的三种类型的属性。

 

cargille浸油

属性

型号 A

型号 B

型号 NVH

nF
(Hydrogen F-line)

1.5236

1.5236

1.5227

nC
(Hydrogen C-line)

1.5115

1.5115

1.5118

nD
(Sodium D-line)

1.5150

1.5150

1.5150

ne
(extraordinary)

1.5180

1.5180

1.5176

Mean Dispersion (nF - nC)

0.0121

0.0121

0.0109

Abbe Number
 (VD)

42.6

42.6

47.2

Temperature Coefficient
(-dn/dt)

0.00033

0.00033

0.00031

Fluorescence (ultraviolet)

very low

low

low

Viscosity
 (cSt or mm2/s)

150 (low)

1250 (high)

2100
(v. high)

1

 

与普通的浸油的一个主要的问题是其固有的高的吸收特性,在紫外区域的频谱(低于约375纳米)。这并不影响与浸没介质所做的可见光的光学显微镜的多数,但它可能会导致麻烦,当试图在低于400纳米的波长的图像标本。甘油的紫外线吸收在400-350纳米的区域是可以忽略不计的,所以纯溶剂,或90:10的与水的混合物,可用于与近紫外显微镜浸没技术。

 

红外(IR)显微镜与工件所产生的超过700纳米的波长处吸收的浸渍材料也很复杂。红外显微镜的唯一实际媒体是石蜡油,这也是有用的荧光浸没显微镜,因为它具有可忽略不计的波长处的荧光下降到350纳米。

 

表2中列出的浸渍介质的折射率和有广泛的各种不同的光学显微镜技术是有用的。大多数等于或低于玻璃的折射率的介质中使用的共同的生物学明场,相衬,DIC,和荧光显微镜。使用具有非常高的折射率,如溴萘和二碘甲烷,与专门的物镜的那些媒体,以实现最高的数值孔径和分辨率可能,也是非常有用的材料,其具有非常低的或变化的反射率的反射光显微镜中。

 

常见的浸式介质

物质

折射率

空气

1.0003

1.333

甘油

1.4695

灯油

1.480

柏木油

1.515

全合成机油

1.515

苯甲醚

1.5178

溴代萘

1.6585

二碘甲烷

1.740

2

 

现代的组织和细胞培养技术的进步已经引发了兴趣,能够对图像的活细胞和组织,都沐浴在生理盐水溶液。生物体组织内的细胞动力学目前正在大量研究与定量的光学成像技术,包括共聚焦,微分干涉对比(DIC),和落射荧光显微镜。活细胞的平均折射率为1.35,非常接近周围的缓冲水,生理盐水组(n =1.33),必须存在,以支持正在进行的细胞活动。当使用长工作距离干物镜,可视化的液体,将掩盖标本的详细信息,从该表面的反射由于在水溶液中的组织培养细胞时,会出现一个问题。同样地,使用浸油物镜观察活细胞也是有问题的因成像介质和水溶液的物镜的前透镜的玻璃之间的折射率差异。

waterobjs

 

被设计成用于成像缓冲生理盐水溶液中的细胞和组织中的图3中示出的物镜,同时提供足够的房间的标本在观察过程中的微操作。在一个43度角的鼻(或浸渍锥),房屋的前镜片的物镜是锥形的,允许提供方便地访问到标本的机械手或微电极的方法,同时保持标本物镜沉浸在一个陡峭的倾斜的解决方案。这些物镜也有长工作距离范围从2.0毫米(60X平场荧光),3.3毫米(10倍 - 40平场荧光),使标本的显微操作的额外的空间,同时也是有用的。在这一系列的物镜是可比的数值孔径(通常是略高)典型的干平场荧光。这种类型的生产显微镜的主要公司,包括奥林巴斯蔡司徕卡尼康物镜往往是制造商提供额外的配件,用于组织培养标本和其他生物标本的显微。

 

一个很好的示范精致的细节,看到水浸泡物镜的分辨率和增强生活在组织培养的大鼠提睾肌的观察图4所示。

rats

 

4a)是位于正上方的空气/水界面的一个正常的干燥的4物镜采取大鼠组织的显微照片。注意标本的失真和模糊的发生是由于从水的表面的反射。这些效果被消除在图4b),这是相同的视野的显微照片,但使用一个4x水浸物镜。此图片是相当清晰的,较干燥的物镜提供精致的细节显示更高的分辨率。

 

与成像的组织样本的另一个问题是审查标本在高放大倍率时所表现油浸物镜的分辨率和照度的有限的范围内。在深度超过10微米的标本时,覆盖盖玻片,沐浴在水溶液中的浸泡物镜通常失去其出色的成像性能。此问题在图5中示出(a)如射线追踪表明,在水介质中的一个球体扭曲成一个显然是细长的椭圆形,当使用通过浸油具有n=1.515标本图像的油浸物镜。

distortion

 

相同的球体保持球形,即使当使用水浸物镜的成像光线仍然必须通过的折射率等于1.515的玻璃盖玻片。水浸泡的物镜还消除观看标本通过水溶液时,往往会产生的球面像差。这些先进的物镜还具有增加的轴向分辨率,经常等于数值孔径的理论限制,它们产生特殊的对比度,分辨率,和提供了更高的照明强度。

 

油浸显微镜技术提示 

显微镜中的第一规则是保持光学元件完全自由的灰尘,污垢,油,溶剂,和任何其他的污染物。显微镜时,应保持在低振动无烟房,可能是干净的循环空气的干扰最小。在显微镜上使用了防尘罩在不使用时,在密封的容器内,并保持所有配件。避免使用腐蚀性溶剂来清洁的显微镜,只能使用稀释的肥皂水清洗非光学表面。油应保持技术和头脑中的注意事项:

 

第一步是找到一个低倍率物镜和位置显微镜载玻片,让标本与感兴趣的区域是正视载物台开口的中央部中。人们常常希望旋转浸没物镜(无油)到位,以确保正确的位置的标本。为了达到最佳的结果,当使用油浸渍技术是很重要的,也适用油的底面的显微镜载玻片和最佳台下聚光透镜的形成两者之间的,如下所述的油珠。大多数现代显微镜提供了一个相对宽的椭圆形的开口中的机械载物台,以允许油显微镜载玻片的底部和在聚光镜的前透镜之间的区域中使用。

 

摆动油浸物镜的位置在物镜转换器,这将是下一个物镜的光学通路旋转到正上方的标本。使用一块无绒纸或滴管将一小滴的油直接在镜头前的油浸物镜。下一步,将另一滴的油盖玻片上的正上方的区域进行成像。许多较新的奥林巴斯和尼康生产的油浸物镜使用平凹前镜片在浸泡物镜,这是必要的步骤注油的物镜前透镜不能省略这些物镜的。如果这些物镜,以填补凹腔,可能会导致截留一个微小的气泡,造成严重的眩光和图像质量下降。

 

慢慢地降低石油的物镜,在显微镜的盖玻片使用粗调焦旋钮成小的油池。当油覆盖的物镜前透镜使盖玻片上的油接触时,一个小闪光灯的散射光会被排放在油交界处,这两个油池,合并。此步骤要非常小心,因为货架的物镜太靠近盖玻片,可能会导致两者之间的碰撞,有可能造成损害。

 

将样本慢慢地成为关注的焦点,使用粗调,直到细节才刚刚开始成为可见的,然后切换到适当的焦距微调,将样本。它是重要的,以记住,在工作距离的最荧光和复消色差透镜的物镜是减少超过十分之一毫米的,在一个很窄的范围内调节微调旋钮,所以仔细监视的物镜的做法油池而降低它的粗或细的调整。虽然大多数高倍率的浸油的物镜有弹簧加载的可以缩回到主体的物镜,这些物镜的不小心使用的前端仍然可以驱动物镜进入标本滑动造成损害。

 

许多显微镜所使用的另一种方法是在显微镜的光路中,使用较低的倍率物镜的中心的区域将被成像的位置。接着,油浸物镜(无油的情况下)被放置到光路中,并且标本的感兴趣区域的大致中心的视野带入并集中。此预位置所有准备加入油中的系统组件。浸没物镜摆动显微镜物镜转盘相邻站和适用油的物镜前透镜和标本如上面所讨论的。接下来,快速旋转上油的物镜,上述两个油滴(对标本物镜之一)合并到一个池中的样本的位置。现在已经准备好标本是观察和显微摄影。

 

适用于石油台下聚光镜头前,使用以下考虑:

请肯定的是,在显微镜的机械载物台具有足够的尺寸的开口,允许扫描不溢出的情况下的载物台的底部上的油在油标本。许多先进的的研究显微镜有一个载物台插入是可移动使用油。涂油的聚光镜顶级镜头前取出标本的显微镜载物台。

 

在注油一个物镜的类似的方式,放置在显微镜载玻片上的底部和一滴油台下聚光的前透镜的应用类似的下降。确保聚光镜略有下降,在舞台上的显微镜载片上,然后再更换机架。幻灯片后一直放置在舞台上,机架背面的聚光镜,到适当的位置,同时仔细观察油滴的聚光镜和显微镜幻灯片。这些液滴合并成一个,作为的聚光镜被带到正确的位置。

 

当您扫描的表面上油显微镜幻灯片,定期观察载物台方面的物镜聚光镜的前镜头,以确保有一个连续的液滴这些元素之间的石油和显微镜幻灯片的位置。显微镜载片上在大面积上进行扫描时,它往往是必要重新应用一些油以保证连续性的成像介质。

 

保持镜头的清洁,无油

一直努力,以确保您的显微镜的物镜和聚光器前镜头保持清洁和浸油。许多制造商广告非干燥,据报道,有这样的蒸气压高的溶剂不会蒸发,留下结晶光学表面上的残留物的浸油。在某些情况下,这可能是几乎真实的,但它是危险的赌注,昂贵的光学设备。使用Q-尖或无绒纸或布轻轻擦拭多余的油的镜头和显微镜幻灯片实验完成后,。后的油被除去,使用合适的溶剂中,以除去微量的浸渍油从镜片。不正确清洁镜片,可能会导致小晶粒上形成的涂层表面时浸泡的油干燥或收集从大气中的灰尘和其他污染颗粒。