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尼康显微镜:物镜的盖玻片校正

2013-10-16  发布者:admin 

 对于具有高数值孔径的光学性质和厚度的介质躺在前透镜元件和所述试样之间的严重影响的必要的计算,以满足消球差和正弦条件,以及以其他方式校正图像畸变的显微镜物镜。

correction collar figure1

如果均质物镜被设计为使用浸油,盖玻片,和吸液的检体,匹配的物镜前透镜元件,然后计算过程是简单的介质的折射率和分散液,因为所有的媒体可以被认为是延伸的所述前透镜元件。

 

然而,与非物镜,盖玻片可以成为一个源的色像差,从而增加与盖玻片厚度和分散。 另一光学工件,球面像差,也是盖玻片的厚度成正比。 在设计的物镜,不被用于均匀浸渍,一个假定的存在下,一个标准的盖玻片和其他特定的光学媒体之间的前透镜元件和所述试样。由于条件脱离这些指定的规格,球面像差和彗差的数值孔径的增加而物镜。会出现这种情况,因为较长的数值孔径的切线的入射角的正弦值(这是负责偏离需要校正这些像差的正弦条件)之间的差异变得更大。

 

使用油浸物镜时,它可能会出现,盖玻片厚度是有限的关注,因为它的折射率近似匹配,浸油。 这是真实的,当样品被安装在加拿大香脂或其他安装介质折射率类似于盖玻片。 然而,它不再是真实的试样被安装时,例如,在生理食盐水或其它含水介质,其折射率是显着不同的盖玻片。 在这些条件下,即使聚焦通过一个薄的水层,只有10微米厚的可导致明显的像差和点扩散函数PSF的上方和下方的焦平面,不再对称。 这是因为油浸物镜的设计假设,均匀地浸标本。 样本,除非区域相邻的盖玻片(甚至在含水环境中),来计算的像差校正光学假设不再有效。

 

一旦这一特点的油浸物镜的行为被确认,显微镜制造商开始生产修正后的水浸物镜1994年左右)。 平常APO水浸物镜的配备校正衣领的数值孔径在1.2左右,(即使他们有一个较小的数值孔径比他们的浸油)是通过水的解决方案能够克服固有的局限性成像(见图2)。 最新的水浸物镜的设计现在可以集中精力通过约200微米的水介质,仍然保持出色的校正。 不幸的是,这些物镜的价格是非常高的,和图像对焦时,仍可以降低深内折射的组织或细胞元素。

 

correction collar figure2

 

对比度传递一个60x/1.2数值孔径的水浸泡和一个60x/1.4数值孔径的油浸物镜(包括平常复消色差),测量带和不带盖玻片和测试光栅之间的水层,在图2中给出的值。 这些图表表明,水浸物镜执行即使与水层的厚为153微米的对比度传递的理论极限的油浸物镜的对比度传递函数,而显着降低,并减少一半的分辨率极限,当测试光栅成像,通过一个50微米厚的水层。 连续行,理论上计算出的对比度传递函数无像差的相应的数值孔径的物镜,在546纳米的波长。

 

correction collar figure3

 

对于一个标准的的盖玻片厚度和折射率/分散液(0.17毫米nD= 1.515),偏离标准厚度与设计用于的物镜是不是太关键物镜具有一个数值孔径为0.4或更小(如列于表1)。 然而,对于高数值孔径的的非均质油浸物镜,这个问题变得尤其重要,这样离境盖玻片厚度甚至两微米或降低的图像与数值孔径0.65或更大的物镜。 这个概念在图3中所示,呈现所计算出的最大强度的在盖玻片厚度相对于偏差的一个点对象的图像,从理想值0.17毫米,作为客观的数值孔径的函数。 为了弥补这样的错误,以及校正后,高干物镜配备校正,可以利用调整其根据盖玻片厚度的中间透镜元件的间距的项圈。 以相同的方式,物镜设计用于查看通过硅树脂或塑料的层,或不同的浸没介质(水,甘油,油),配备校正铤。

 

盖玻片厚度变化的性能下降

数字的 
光圈

0.01毫米偏差

0.02毫米偏差

0.30

没有

没有

0.45

没有

没有

0.70

2

8

0.85

19

57

0.95

55

71

1

 

盖玻片的标准厚度为0.17毫米,它被指定为一些第一½玻璃盖。 不幸的是,并非所有的1½盖眼镜制造这种紧密的公差,许多标本有媒体和它们之间的玻璃盖。 盖玻璃厚度的补偿可以通过利用专门的校正领子的改变镜筒内的物镜,关键的透镜元件之间的间距,通过调整机械管长度的显微镜,或(如前面所讨论的)。 修正环进行调整,以弥补这些细微的差别,并确保最佳的物镜性能。 适当的应用程序的显微镜物镜与校正铤要求有经验,有足够的警惕,重设领,使用适当的图像标准。 在大多数情况下,重点可能会转移和图像可以漫步在调整过程中的修正领。 使用下面列出的步骤,同时观测样品图像的变化,使微小增量调整物镜的修正领。

·修正的物镜桶上的指示标记,以便领恰逢0.17毫米刻度刻在领住房的位置。

·标本放置在载物台上,集中在一个小样本的显微镜功能。

·非常轻微的旋转校正铤并重新聚焦的物镜,以确定是否有所改善的图像或退化。由于遭受玻璃盖/媒体三明治太粗的事实,大多数样品准备,开始旋转实验,试图补偿值(0.18-0.23)第一。

·重复前面的步骤,以确定如果图像被改善或降解作为校正衣领是在一个单一的方向上转动。

如果图像有下降,按照同样的步骤,向相反的方向旋转校正领(向较低的值)找到的位置,提供最佳的分辨率和对比度。

1示出一个具有0.85的数值孔径的配备用于聚焦在表面上或通过一个盖玻片最多至1.5毫米的厚度,而不改变透镜系统的焦距设置的校正铤60x物镜的一个例子。 在光学列车的中心的可调节透镜组是胶合的三重峰,可以被重新定位,以适应在盖玻片厚度的变化。