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奥林巴斯显微镜:柯勒照明系统

2013-10-16  发布者:admin 

标本的照明是最重要的变量,在实现高品质的图像在显微镜和显微摄影的关键。科勒照明中首次引入了1893年8月克勒(Köhler)的卡尔·蔡司公司提供最佳的标本照明的方法。

Köhler Illumination

建议所有制造商的现代实验室显微镜这种技术,因为它可以产生样品是均匀的亮度和眩光的照明,从而使用户实现显微镜的全部潜力。

制造商已经设计现代显微镜,使集电极透镜和进入显微镜的基础上构建的组件的任何其它光学的孔径光阑的正确定位的载物台下聚光的平面上投影的放大和聚焦图像的灯丝。关闭或打开聚光镜隔膜控制新兴的从聚光镜和从所有方位角到达标本的光线角度。因为光源没有被聚焦在水平的标本,在标本的水平的光基本上是grainless和扩展,不会受到从聚光镜玻璃表面上的灰尘和不完善的劣化。聚光镜孔径光阑的打开和关闭的控制的角度到达检体的光锥。聚光镜的孔径光阑的设置,以及与孔的物镜,确定实现的数值孔径的显微镜“系统”。作为聚光镜振动板被打开时,正常工作的数值孔径的显微镜的增加,导致更大的分辨力和光透射率。平行光线通过并照亮标本带来集中在后焦平面的物镜变量,聚光镜孔径光阑的图像和图像的光源,其中,可以看出,在焦点。

光路径在图1中示出的示意性绘制表示所采取的检体照射光射线和图像形成的光线的单独的路径。这是没有这些途径任何真正的偏析,但一个真正的代表性的可视化和讨论的目的提出的图解表示。图1(a)示出的后焦平面上的物镜,和视点(也称为Ramsden圆盘)照明光的射线路径产生一个聚焦图像的灯丝平面载物台下聚光孔径光阑,目镜。共同的焦点是在这些区域通常被称为作为共轭平面,这是至关重要的,实现适当的科勒照明。根据定义,在一个平面上的对象,该对象是在焦点也聚焦在其他的共轭平面,光通路。在每一个光通路(包括图像形成和照明),有四个独立的平面,它们一起组成的共轭平面集。

科勒照明的照明的光线的路径的共轭平面中(图1(a))包括:
·灯丝。
·聚光镜孔径光阑(在聚光镜的前焦平面)。
·后焦平面上的物镜。
·视点(也称为Ramsden圆盘)的目镜,这是位于约二分之一英寸(1厘米),在顶端透镜的目镜上方观察者把前面的眼睛观察时的地步。

同样地,在成象科勒照明光路中(图1(b))的共轭平面包括:

·视场光阑。
·集中的标本。
·平面(即,平面的固定光阑的目镜)的中间图像。
·眼的视网膜的照相机或胶片面。

共轭焦平面通常是有用的,在显微镜进行故障排除污染的光学元件中的灰尘,纤维,和不完善。如果这些文物是大家关注的焦点,因此,它们必须位于或接近表面的成像形成的共轭平面的一部分。这个集合的成员包括玻璃元件在显微镜光端口,样品,在目镜的分划板,和底部的透镜元件的目镜。另外,如果这些污染物模糊和重点,找他们共享共轭平面附近的照明。在这个类别聚光镜顶部透镜(如灰尘和污垢常常累加),暴露的目镜透镜元件(从睫毛污染物),和物镜前透镜(通常指纹污迹)。

图2示出一个典型的显微镜安装在灯壳体(照明源)连接到基座和投射光被反射后,由反射镜在显微镜底座通过几个镜头和然后通过载物台下聚光。光源本身应该显微镜的光轴precentered或定心。从钨 - 卤灯灯丝发射的光首先通过靠近灯壳体通过聚光透镜,然后再通过接近视场光阑的第二透镜。通常情况下,烧结的或磨砂的玻璃过滤器放置之间的灯,和集电极透镜的光扩散,并确保一个偶数的照明强度。在实践中,灯丝的图像被聚焦在玻璃扩散器的聚光镜的前焦面,而被暂时从光路中除去。集电极透镜的焦距必须仔细灯丝尺寸相匹配,以确保适当的大小,一个灯丝图像投射到聚光镜孔径。对于正确的科勒照明,图像的灯丝应完全填补的聚光镜光圈。

microscope illumination system

所述第二透镜的光路中被称为场透镜,它是负责使灯丝的图像在载物台下聚光孔径光阑的平面成焦点。 (放置在一个45度角度光路径),通过视场光阑,并进入载物台下聚光反射镜反射的聚焦的光场透镜离开。视场光阑作为一个虚拟源的光的显微镜,其图像被聚焦到样品平面聚光镜。这些元素的布置的光学设计由显微镜制造商可能会有所不同,但应被定位在一个足够的距离,从场透镜,消除灰尘和镜头缺陷的标本平面成像视场光阑。

在基座的显微镜视场光阑的宽度仅控制束光线到达聚光镜 - 它不影响的光学分辨率,数值孔径,或者照明的强度。的视场光阑(即,集中在光路中,并打开,以便刚好位于的视场以外的)的适当调整是很重要的,以防止眩光比可以降低所观察到的图像中的对比度。消除多余的光线是特别重要的,当试图固有的低对比度图像样本。当视场光阑开得远,从标本在倾斜的角度从光学表面的反射光,散射光可以采取行动,降低图像的质量。

载物台下聚光镜的显微镜载物台的下方通常直接安装在一个托架,可以提高或降低独立的阶段,如在图2中示出通过旋转滚花旋钮。孔径光阑被打开和关闭一个摆动臂,杆,或通过旋转聚光镜壳体上的轴环。应该注意的是,载物台下聚光镜是正确的调整可能是最重要的方面实现适当的科勒照明。然而,不幸的是,聚光镜偏差和调整不当聚光镜光圈隔膜的图像质量下降和质量差的显微摄影的主要来源。

condeser llluminating cones

当适当调整时,来自聚光镜的光将与图像形成光通过投射光锥,照亮领域的视图(详尽地讨论载物台下聚光镜填补的后焦平面的物镜包括在另一部分中的引物)。聚光镜孔径光阑是负责控制的照明光锥的角度,因此,在聚光镜的数值孔径。这个概念在图3中示出,其中一系列与光锥(数值孔径)的减小尺寸图中从左至右示出的聚光镜。聚光镜光锥形状也是光学像差的校正的程度的函数

图3(a)示出了聚光镜的数值孔径约为1.20,具有广阔的允许的试样具有高的数值孔径物镜成像的光锥。图3(BD)显示了如何减少的孔径光圈的大小会产生相应的光锥的大小以及数值孔径的减少(图3(b)NA= 0.60,图3(c),NA =0.30,图3(d )NA= 0.15)。我们还构建了一个互动的Java教程,演示了如何聚光镜光锥的大小和形状各不相同数值孔径。

重要的是要注意,相对于聚光镜光锥的大小和形状,即仅减少视场光阑的大小稍微减小的尺寸在图3中示出的光锥的下部。的角度和数值孔径的光锥与视场光阑的大小减少,基本上保持不变。 ,常常由新手忽视,另一个重要的概念是,不应该被控制,通过打开和关闭聚光镜孔径光阑,也不是由聚光镜转移显微镜光学中心相对于轴向的照度。光照强度只应通过使用中性密度过滤器放置到光路中,或通过降低电压的灯(尽管后者通常还没有建议,特别是对显微摄影)控制。钨卤素灯,以确保最高的性能,请参考生产商的仪器手册,以确定最佳的灯电压(通常为6-10伏),并使用该设置。的照明亮度,然后,可以容易地控制中性密度过滤器通过添加或删除。

载物台下聚光孔径光阑的大小不仅应该一致所需的数值孔径,但也应考虑所得到的图像的质量。通常,孔径光圈应该被调整,以提供足够的图像的对比度,而不被关闭的点引入的分辨率和细节的损失。折光指数和固有的标本对比度确定的孔径光圈的大小是非常重要的。在一般情况下,隔膜应设置为60至90%的整个光盘大小(可见在眼管除去目镜后或与伯特兰透镜)的位置,使上,虽然这可能会随极端标本对比度。

聚光镜光圈设置由显微摄影拍摄的图像的质量的影响在图4中示出。样品是薄款的椴树(椴木)干与固绿的曙红染色和使用的40倍Planachromat物镜(NA =0.75)和旋出顶部透镜消色差聚光镜(NA =0.90)Fujichrome 64T透明胶片拍摄的。近似​​聚光镜光圈孔径设置为:图4(a) - 90%(NA =0.81),图4(b) - 60%(NA =0.54),图4(c) - 20%(NA =0.18)。组织部分是选择性的颜色染色透露精致的细节和亚细胞成分差异的观察。

condenser aperture size image quality

在图4(a),其中孔径光阑被设置到一个位置,在该位置的聚光镜和客观的数值孔径,几乎是相同的,大部分的细试样细节是可见的,但仍然有相当数量的散射和眩光。也是显着的图像的亮度比其同行,其中的孔径光阑与一个较小的设置作了。图4(b)示出的椴树茎标本,聚光镜光圈大小,物镜产生约70%数值孔径。减少了眩光,图像是非常尖锐的,精细的图像细节是不显着的衍射文物。对于该标本,在图4(b)表示的显微照片聚光镜孔径光阑的最佳设定。当光圈已关闭设置到最小的在25%左右的物镜数值孔径(图4(c)),精细的图像细节变得模糊,与的衍射文物和折射现象。图像也需要较暗的整体投射,产生的检体中色调变化。

从上面的讨论,这是显而易见的,应该被设置为提供一个折衷的混合物的直接和偏离光,在很大的程度上取决于试样的吸收,衍射和折射特性的位置,将聚光镜孔径光阑。这必须完成,没有铺天盖地的图像与文物,晦涩的细节和目前错误的对比度提高。必要以产生最好的显微照片的图像的细节和对比度的量也依赖于折射率,光学特性和其他试样相关的参数。

当孔径光阑被错误地关闭太多,偏离光开始模糊直接照明光线,导致引起可见条纹的衍射工件,带状物,和/或图案形成的显微照片。其他问题,如折射现象,也可以产生明显的结构是不是真正的图像。另外,打开聚光镜的光圈太宽,从标本,在显微镜的光学表面产生多余的眩光和光散射。这会导致图像细节的对比度和洗出到一个显着损失。正确的设置会有所不同从标本,和有经验的显微镜技术很快将学会准确地调整聚光镜的孔径光阑(及系统的数值孔径),而无需通过观察图像,以查看在光圈中的后焦平面的物镜。事实上,在显微摄影,许多显微镜认为关键减少的显微镜系统的数值孔径,以优化图像质量是最重要的一步。

在显微镜的照明系统中,调整为适当的科勒照明时,必须满足几个要求。标本平面的照明面积必须是至少一样大的视场任何给定的物镜。此外,光必须是均匀的强度的数值孔径必须从最大(等于物镜)最小的值,该值将取决于试样的光学特性的变化。表1为每一个物镜列出了物镜的数值孔径,范围从很低到很高的放大倍数与磁场的观点直径(目镜的视场数18)。

Objective Designation

Numerical
Aperture

Field of View Diameter

Planachromat 1x

0.04

18.0

Planachromat 2x

0.06

9.0

Planachromat 4x

0.10

4.50

Planachromat 5x

0.15

3.60

Planachromat 10x

0.25

1.80

Planachromat 20x

0.40

0.90

Planachromat 40x

0.65

0.45

Planapochromat 50x

0.90

0.36

Planapochromat 60x

0.95

0.30

Planapochromat 100x

1.40

0.18

从表1中所给出的数据,很明显,从1x Planachromat到100倍Planapochromat字段中的变化的观点直径是100倍。这将产生一个惊人的1x和100倍的物镜之间面积上照度在10,000倍的差异。这样宽的范围内照明领域需要调整的光路中的许多组件,以容纳所有的放大倍率。这些计算假设目镜视场数为18,但许多现代的显微镜都配有宽视野目镜的市场数20或25。视野的字段(如表1中的第三列中给出的),可以重新计算的任何目镜使用下面的公式:

D = (FN) / M
其中D是的视场直径,FN是目镜视野数,M是物镜放大倍率。

现代显微镜都配有专门的的载物台下聚光镜,有一个摆动离开透镜,它可以从光路的使用低功率的物镜(2倍至5倍)除去。这改变了在光路中的其余组件的性能,和一些调整是必要的,以达到最佳的照明条件。视场光阑可以不再被用于对齐和定心载物台下聚光,现在是在光照条件下的样本区域限制无效。此外,一旦除去视场光阑,多余的眩光被减少,因为在聚光镜产生最佳透镜的光锥,具有低得多的数值孔径,使光线穿过试样,在低得多的角度。最重要的是,科勒照明的光学条件不再适用。

应始终对准显微镜的光学元件和科勒照明条件的建立在更高的(10倍)的放大倍率进行之前除去摆动离开工作以低级(5x和下文)的放大倍率的聚光透镜。然后,在聚光镜的高度应不被改变。摆动上透镜从光路中摇出,聚光镜的性能从根本上改变。不再形成的灯丝的图像中的孔径光阑,其中停止控制在聚光镜和照明系统的数值孔径。事实上,应完全打开的光圈光阑以避免渐晕,光在视场边缘逐步衰落。

在图5示出修改后的用于在低功率显微镜系统的透射光的光学路径。视场光阑现在定位在正确的平面作为孔径光阑,以控制照明和成象光线穿过聚光镜的数值孔径的大小和形状的光锥。标本平面充分照明的等角视锥细胞(如在科勒照明),但是灯丝现在在背面的镜头卡口的物镜,而不是后焦平面成像。

low magnification light pathways

重要的是要注意,视场光阑的图像不再是在标本平面形成的,虽然仍然是均匀的视场范围内的整体强度的照明,提供灯聚光透镜稍有扩散(化学蚀刻)或磨砂。

对比度调节在低倍率的显微镜是类似的程序,使用高倍率物镜,如在图4中示出。当视场光阑是敞开的(大于80%),标本详情被洗出,存在一个显着量的散射和眩光。关闭视场光阑,50%和80%之间的位置,将产生最佳折中样品的对比度和景深。低倍率为设计物镜是简单的设计比他们更高的放大倍率。这是由于以较小的角度的照明产生的光锥由低倍率聚光镜,需要较低的数值孔径的聚光镜。

测量光罩,它必须是在清晰对焦和叠加在检体图像,可以被插入到上面讨论的几个的共轭面。最常见的的目镜(眼)测量和显微摄影光罩被放置在中间像平面中,这是一个固定的孔径光阑内目镜。这在理论上是可能的,也放置在试样平面或在平面上的照明视场光阑的光罩。舞台微米是专业的“光罩”放置于microslides,这是用来校准目镜分划板,使样品测量。从未做过名次光罩的平面中的视场光阑(就我们所知),就需要非常高的用于像差校正的聚光镜完全消除工件和用于测量提供一个清晰的图像。

彩色和中性密度过滤器经常被安置的光学路径内,以减少光的强度和改变的颜色特性的照明。这些过滤器通常放在显微镜支架内有几个位置。一些现代化的实验室显微镜持有人之间夹灯住房和聚光透镜,作为一个理想的位置,这些过滤器的过滤器。通常情况下,中性密度滤镜的色彩校正过滤器和磨砂扩散过滤器放在一起,在此过滤器的持有人。其他显微镜的设计提供了一组可以通过一个杠杆入光路切换到身体内部构建的过滤器。用于过滤器的第三个共同的位置保持器是一个安装在底部的台下聚光,明显低于光阑的,将接受的明胶或玻璃过滤器。

重要的是不能将过滤器内或附近的任何图像形成的共轭平面,以避免在过滤器上的污垢或表面缺陷要成像与样品一起。显微镜有一个附件,在底座附近的光端口的过滤器放置(附近的视场光阑)。这个位置可能是太接近视场光阑,表面污染可能是大家关注的焦点,或出现叠加到图像的模糊文物。过滤器将直接在显微镜载物台,出于同样的原因,同样也是不明智的。