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徕卡显微镜荧光观察法

2013-10-16  发布者:admin 

荧光观察法在医学领域有着广泛的用途,如免疫学研究的对象是抗原和抗体的反应问题,由于抗体反应的高度特异性,所以当抗原体发生反应时,只要知道其中一个因子,也就可以知道另一个因子。
但是这个过程必须通过染色,荧光染色剂就应运而生。
由于荧光染色的色素只需极稀的浓度便能使激发出明亮的荧光。因而,染色后不会破坏抗体(或抗原)原有的特异活性。
其光学原理示意图如下,以蓝光激发为例:

荧光激发光学原理图

激发滤光片                                     荧光本                       截止滤光片

 

光源发出多种波长的光线,经激发滤光片后只能通过某种单色的激发光,荧光标本在激发光作用下,激发出某种特定的颜色光(荧光)。由于被激发的荧光能量很弱,只能在黑暗的背景才易于观察
到,所以增加了抑制滤光片使残余的激发光不能通过。
早期的荧光观察采用透射照明,它有很大的缺陷,当激发光透过标本组织时,很大部分的光线被衰减掉,到达我们需观察的标本上表面时,只能激发出微弱的荧光。
近代的荧光观察采用落射照明,如下图所示:

荧光落射照明图中 :
1.光源
2. 激发滤光片
3. 物镜
4. 标本
5. 二向性分光镜
6. 抑制滤光片
7. 目镜

 

 

 

 

 

 

A> 光源
根据不同的激发光需要,可以选用三种光源,卤素灯,高压汞灯和氙灯。下图列出菲利浦公司高压汞灯和氙灯的光谱特性曲线。

高压汞灯的光谱特性曲线氙灯的光谱特性曲线

高压汞灯的光谱特性曲线                          氙灯的光谱特性曲线

 

由图知,高压汞灯是线状光谱,对于某些波长光线有很高的强度,它适用很多染色法。
氙灯在300~800nm 波长内几乎可以看作连续光谱,虽然是某些波长的强度不如汞灯,但它适用于所有荧光染色法。
卤素灯也是连续光谱,它在蓝光,绿光处也有较高的强度(但远低于汞灯,氙灯)因此,对于只用蓝光,绿光激发的简易荧光显微镜可以选用卤素灯。
通常采用50W汞灯,100W 汞灯75W氙灯及100W 卤素灯作荧光光源。
图中物镜既起成象作用,又起聚光镜作用。为了获得很好的观察效果,在荧光很微弱的场合如细菌发出的荧光。建议采用大数值孔径物镜,如徕卡的荧石物镜,平场复消色差物镜。
正因为物镜又兼聚光镜作用,所以物镜中玻璃材料,透镜间胶合剂,以及浸油必须确保在激发光下不会自发荧光。
为了使用方便,常将激发滤光片,二向性分光镜及抑制滤光片组合成一个模块。对于不同的荧光染色法,必须选用合适的模块才能得到满意的结果。所谓二向性分光镜对激发光具有高反射率,而对激发出的荧光具有高透过率。

B> 常用荧光模块
一般荧光模块有如下四种:
近紫外光激发模块――UV、 紫光激发模块――V、 蓝光激发模块――B、 绿光激发模块――G
这些模块对应着不同染色法,如B 模块常用FITC 染色法,G 模块常用罗达明B200 染色法。
必须特别指出,激发光的波段曲线绝对不能与抑制光的波段曲线部分重迭,否则,视场中的背景
光全部是激发光的颜色,而微弱的荧光完全被掩盖住,正如白天天空中无法看到星光一样。

激发光的颜色激发光的颜色

1─激发光 2─抑制光

 

蓝光激发如用FITC 染色法,它的激发波段为480~490nm,被激发的荧光波长为510nm。由图知,无论激发光或抑制光在500 nm 处均截止,无相交重迭。所以,残留的激发光无法通过截止滤光
片,视场背景是黑暗的,而荧光则可顺利地透过截止滤光片,形成荧光图像。
徕卡公司设置了许多模块,供不同的染色法选用:

滤光片模块代号

激发光范围

激发滤光片

二向性分光镜

截止滤光片

A

紫外光

BP340-380

RKP400

LP425

D

紫外光+紫光

BP355-425

RKP455

LP470

E4

蓝光

BP436/7

RKP455

LP470

H3

蓝光

BP420-490

RKP510

LP515

I3

蓝光

BP450-490

RKP510

LP515

K3

蓝光

BP470-490

RKP510

LP515

L4

蓝光

BP450-490

RKP510

BP515-560

M2

蓝光

BP546/14

RKP580

LP590

N2.1

绿光

BP515-560

RKP580

RKP580

TX

绿光

BP530-595

RKP600

LP615

G/R

绿光

BP490/20

RKP505

BP525/20

蓝光/绿光

BP575/30

RKP600

BP635/40

B/G/R

紫外光/蓝光/绿

BP400/20

RKP415

BP530/30

BP495/15

RKP510

BP640/40

BP570/30

RKP590

BP610/75

注意:
许多荧光标本无法长期保存,特别在激发光照射下,荧光很快消失。所以,在停止观察时,应该将激发光挡。但是汞灯开启到熄灭后,第二次再启动时,必须待灯源冷却后才能进行。为此,须在模块前设置一挡板(Shutter),可随时关闭、开启。

荧光显微镜 荧光“激发 发射”模块

                                           荧光“激发 / 发射”模块

                                                                                                                                        

 

标本图像

标本图像(蓝光激发)                                              标本图像(紫外光激发)

 

标本图像(绿光激发) 标本图像(蓝光+紫外光激发)

标本图像(绿光激发)                                      标本图像(蓝光+紫外光激发)



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