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透明细胞:徕卡显微镜的相衬观察方法

2013-10-16  发布者:admin 

相衬观察法用来观察无色透明或不染色的活体标本。因为人眼只对亮暗、颜色有识别能力。而这些无色透明的活体,除了折射率与周围介质不同而引起位相的不同外,其亮度与周围介质的亮度完全一样。所以用普通的明场观察无法察觉到这些透明体的存在。如下左图表示光线透过上述的标本。

光线透过上述的标本光与电磁波一样也是以波动的形式存在。我们用一正弦波来描述,波峰值称为振幅,它的平方值即代表亮度(能量)。

 

 

 

 

 

 

振幅和相位图下图中的“1”表示透过周围介质的正弦波。“3”表示光线透过标本时产生的衍射光,它的能量很弱(图中已作了夸大修饰)。“2”是曲线“1”与曲线“3”迭加的波形。
因此,曲线“1”表示观察背景光的亮度,曲线“2”表示标本成象的亮度。
可见曲线“1”与曲线“2”波形相同,仅仅位相不同而已,这就是明场观察所得的效果。成象光与背景光同样亮度,人眼无法察觉透明体的存在。

 

 

 

我们设法将直射光“1”的位相改变90°(超前或滞后),如下图。直射光“1”与衍射光“3”位相差180°。那么,合成波形“2”与波形“1”相比振幅略有改变,但还不足以达到满意的程度。

振幅和相位图

如果,我们设法将直射光“1”的能量衰减75%,如下图。那么波形“2”将与横坐标重合(为了识别,图中作了夸大修饰),与波形“1”有明显的差别。观察的效果是,在较暗的背景下,看到黑色的透明体,这就是相衬观察法。

因为相衬板的膜层厚度根据绿光(e 光)镀制的,使用时应用绿色滤光照明。

振幅和相位图

 

相衬观察法的光学原理图左图为实现相衬观察法的光学原理图。
图中:
1. 环形光阑 2. 聚光镜 3. 物镜 4. 相衬板
通过环形光阑的光束称为直射光。环形光阑常位于聚光镜的焦面上,光束经聚光镜后以倾斜的平行光束照明标本。再经物镜后,使环形光阑的象成在相衬板上。相衬板上镀有改变位相及减弱光能的膜层,它也是环状的,但其尺寸比环形光阑的象稍大。
相衬板的环形必须完全覆盖环形光阑的象(允许偏心),见图示。换句话说,也就是通过环形光阑的直射光,只能从环状相衬板中通过,不允许从环状相衬板外通过。
徕卡公司有简易相衬装置与标准相衬装置之分。所谓简易相衬装置由普通聚光镜环形光阑插板,相衬物镜及绿色虑光片组成。不同倍率的相衬物镜必须与不同的环形光阑配合使用。

 

 

 

 

 

 

 

相衬物镜倍率

5 倍

10倍及20 倍

40倍

100 倍

环形光阑代号

Ph0

Ph1

Ph2

Ph3

 

相衬环板    相差环板对中情况

                                  未对中                对中良好

 

对简易相衬装置来说,由于产品离开公司前,环形光阑的中心与相衬环中心已校正好。因此,一般不再配校准环行光阑“对中望目镜”。

 

转盘聚光镜标准相衬装置由转盘聚光镜、相衬物镜、绿色滤光片、对中望远镜及二个内六角扳手组成。
转盘聚光镜通常带有五个或六个园孔,内置Ph0、Ph1、Ph2、Ph3 四种环形光阑,一个暗场环形光阑DF 和一个用于明场物镜观察的通孔。通过二个六角螺钉扳手,可以对环形光阑进行调中。对中目远镜插入目镜管可以观察到环形光阑图像与环形相衬板对中状况。
我们上面所介绍相衬图像比背景光暗,称为正相衬。反之,图像比背景明亮称为负相衬。
需要指出,相衬物镜也可以作为普通的明场物镜使用。只是由于能量分布的改变,以及杂散光的增加,图像对比度稍逊一些。

 

相衬图片