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荧光显微镜技术

2013-10-16  发布者:admin 

显微镜光学技术对显微结构与显微变化是极为重要的工具.

荧光物质 ( 荧光染剂 ) 受到较短波长的光 (  FITC : Ex:488 nm ) 及足够的能量所激发当要回到稳态的能阶时会释出较长波长的荧光 (  FITC : Em : 515 nm ), 非荧光物质则成为黑色的背景.

自体荧光 ( auto-fluorescence )又称为主要荧光 ( primary fluorescence ), 是物质本身无荧光染剂也能自体产生的荧光现象., 一般此种荧光会影响实际要观察的样品或者其自体荧光会干扰覆盖实际要观察的荧光让我们无法真正的判定荧光产生的物质及部位在那里所以利用特定的荧光染剂来表现特定的物质与部位此种由染剂所释出的荧光我们一般称之为次级荧光 ( secondary fluorescence )

 

 显微镜光路

 

显微镜的荧光影像技术取决于下列主要因素 ( 除了显微镜本身光学系统的优劣之外 ) :

1). 样品处理

2). 荧光染剂 ( Fluorochrome = Fluorescent dye )

正确的选用荧光染剂必须将背景洗净注意其荧光漂白时间也须留意其酸硷值的变化.

新一代的染剂愈来愈多 Multi-color GFP, DsRed, nanocrystal… etc. 在使用时必须特别注意所匹配的激发光源及感测的光谱范围.荧光感测是仰赖感测光子的多寡愈多光子 ( Photon ), 荧光影像愈佳.

3). 激发光源 ( Light sources )

一般使用于荧光显微镜的激发光源有高压汞灯及高压氘灯

激发光源
 

高压汞灯 ( Hg 50 W – 使用交流电  Hg 100 W – 使用直流电 )

高压汞灯Hg 50 W一般都用于绿色或蓝色的光谱范围然而, Hg 100W 能提供更为稳定的

光源所提供的强度更为均匀., 较适宜光谱定量分析应用.

高压 Xenon ( Xenon 75 W – 使用直流电)

高压 Xenon灯能提供稳定的电流在连续的可见光光谱范围, Xenon灯提供较固定的光源平均强度.

所以一般都使用 Xenon灯于 UV, Violet 及其绿色或蓝色的光谱范围.

灯泡式的光源缺点之一即是 :

光源都是全光谱分布每一波长的光源其强度都不是恒定且能量较低也不均匀分布

源强度也无法调整样品及染剂的应用上颇难达到理想的控制.

共轭焦显微镜所采用的光源是雷射 ( Laser )., 波长纯一高能量.

4). 荧光滤镜 ( Fluorescence Filter Cube )

荧光激发块
 

每一组荧光滤镜基本上都包括了三个镜片

1). 激发光滤镜 ( Excitation Filter )

因为特定的染剂需要使用特定波长范围的光来当作激发光源 ( 才不致影响到其它不想要检

视的物质被激发 ) 而一般灯泡式的光源 (  Hg 50W, Hg 100W, Xe 75 W ), 所产生的光都含

盖全波长 ( 300 – 1200 nm ) , 所以必须使用激发光滤镜来筛选激发荧光染剂所须的光谱范围

可为 Long-pass, Band-pass, Short-pass ). 激发光滤镜是以特殊的镀膜来产生可筛选波长的

功能例如 BP 450 – 490 nm, 即是仅让 450 – 490 nm 间的光通过用以激发 FITC 染剂.

 

2). 分光镜 ( Dichromatic Mirror 或者 Beam Splitter )

将较短波长的激发光反射至样品.

例如 RKP 510 nm, 即是, 510 nm 以下的光反射至样品然而, 510 nm 以上的光可通过.

3). 释放光滤镜 ( Emission Filter 或者 Suppression Filter )

受检样品中的特定染剂及其它物质被激发后所有被激发的物质都释放出来较长波长的萤

然而荧光仅能在释放光滤镜所选定的特定波长范围内通过此通过的荧光即是我们所要

观察的荧光影像.

例如 : LP 510 nm, 即是荧光光谱超过 510 nm 都能通过滤镜供观察低于 510 nm 的萤

光则被阻挡看不到.

传统的共轭焦显微镜所采用滤镜转盘 ( Filter wheel ), 其内可安装感测光滤镜.

Leica TCS NT2 于每一个 PMT 皆可安装 1 组滤镜飞轮每一个飞轮可安装最多达 7 

的滤镜.

Leica TCS SP 则是以连续式的全波长分光光谱系统来取代传统的滤镜因为有限的滤镜无

法满足染剂的应用更无法满足新一代染剂的使用使用可全波长感测的分光光谱系统

无限制的自订各种感测光谱有如一组无限的滤镜真正达到多工多用途与多使用者的目的.

 

5). 光学镜头解析

 镜头

镜头2
镜头的解析, 是荧光影像质量的重要影响因素之一, 基本上, PL-Fluotar 及 PL-APO 级的油镜能提供较好的光学穿透率., 其中, 又以较高 NA 值 ( NA 值与镜头开口角度 α 成正比 ) 的镜头为好. ( 镜头必须使用折射率 n= 1.518 immersion oil, 一般镜头解析计算, R = n˙ sinα ), 如 : PL-APO 63x/1.32 Oil, PL-APO 100x/1.40 Oil

同样 100x 镜头, 如果使用次一级的 N Plan 100x/1.25 Oil, 则因其 NA 较小, 色差与像差的修正都略逊于 PL-APO 100x/1.40 Oil镜头, 故, 荧光影像质量较差., 在低强度的荧光影像镜检, 表现更是明显.

所以, 荧光影像所使用的光学镜头依序考量应为 PL-APO, PL-Fluotar, N Plan, C Plan, Achromatic.

共轭焦显微镜建议使用专属的镜头其于 R, G, B, 各作有特别的修正 ( correction ), 能提供最高的光学穿透与解析 ( Point-spread resolution ). 其有别于一般镜头.

例如 : PL-APO 63x/1.32 CS Oil (  CS 标示即代表 Confocal System 专属镜头 )

6). 荧光传感器

基本上一般除了利用目镜 ( Eyepiece ) 检视之外绝大部份都使用相机 ( Camera )  CCD 摄影机 来撷取荧光影像.

由于荧光影像一般都较弱故照相时依照荧光强度的强弱分布可能必须使用俱有点测光 ( Spot metering )  俱有长时间曝光的照相系统为考虑因素., 然而, CCD 摄影机则以大芯片 ( CCD Chip ), 冷却式 ( Cooled ), 对极低弱的光有较灵敏感应的黑白 CCD 摄影机为考虑因素. 

使用黑白 CCD 摄影机的原因之一是其比一般彩色 CCD 摄影机感光较为灵敏显像解析较高.

如要取得彩色荧光影像则可通过影像撷取卡 ( Frame Grabber ) 取像以数位影像方式利用软件作 RGB 三原色套色即可 ( 一般利用 Photoshop 软件即可处理彩色套色 ). 如要直接撷取实彩色荧光影像 ( True Color Image ), 则可加装 RGB-滤镜 即可.