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奥林巴斯荧光显微镜使用方法

2013-10-16  发布者:admin 

这里将以奥林巴斯BX53和BX43荧光显微镜为例,来做分析。

System Microscope BX53

System Microscope BX53

 

 

 

 

奥林巴斯和尼康的三波段激发的荧光滤光片组合包括两个很精确的平衡组合(DAPI-FITC-TRITC和DAPI-FITC-Texas Red),每个组合包括三个带通的发射区域,可以选择性的通过蓝色、绿色、黄色、橙色和红色光谱区的激发光。这样的相互辅助作用就可以探究激发滤光片和发射滤光片光谱以及多色反光镜的激发和发射滤光片的改变(为在紫外、蓝光和绿光区的多色荧光标记设计的三波段激发光组合)是如何影响信号级别、光谱交叉、整体滤光性能和图像对比度的。
 
DAPI-FITC-TRITC–这个滤光片组合的设计是用来同时检测DAPI, FITC和TRITC或者其他具有相似光谱的荧光探针。三个窄带激发和发射波段是紫外激发光的特定区和相对应的蓝色发射光,蓝色激发光对应的绿色发射光,以及绿色激发光和相对应的橙色-红色发射光。
 
DAPI-FITC-Texas Red–与标准的DAPI-FITC-TRITC组合相比,这个滤光片组合的设计初衷是为了观察紫外激发-蓝色发射的带通区,和蓝色激发-绿色发射的带通区之间的细微变化。这个设计是为了更好的与Texas Red所需的更大的激发和发射波长结合。多带通区域提供了最佳的探测条件,最小的光谱交叉和噪声,可以同时观察DAPI, FITC和Texas Red,或者具有相似波长的荧光探针组合。
 
 
奥林巴斯荧光显微镜使用方法
 
首先是随即选择的荧光标本出现在Specimen Image窗口,同时紫外-蓝光-绿光的三带通激发光滤光片组合(DAPI-FITC-TRITC)的光谱特征显示在“滤光片组合”(Filter Set Spectral Profiles)栏下。通过选择在“光谱交叉部分”(Spectral Cross Sections)下合适的check box(Absorption或Emission),荧光的吸收和发射光谱交叉的部分(滤光片投射带通的重叠部分)就可以单一或者一起观察了。当一个或者多个check box被激活时,组合的滤光片传送和发射光谱会附加在用于标本荧光观察的吸收和发射光谱(不包括自发荧光的植物标本)上。荧光吸收光谱在辅助区时用褐色填充的,而在相应的发射光光谱区用灰色填充的。滤光片组合的波长特征以较低的位置展示在黑色的长方形box内。这些数值常常根据滑块从左到右转换而更新。
 
为了操作这个辅助部分,使用Filter Set滑块可以将三带宽激发的两个滤光片组合相互转换。因为滑块是由左至右滑动的,所以激发光和阻挡滤光片以及多色反光镜的光谱会同时转换。值得注意的是,持续转换光谱并不意味着任何的滤光片组合都是可能的,也不意味单一的滤光片组合的光谱可以随意改变。在选择的滤光片组合中改变光谱范围很简单,有助于在每一个光学模块中的滤光片组合建立联系。
 
单一的滤光光谱(激发光,发射光和多色反光镜)可以通过选择和去除Filter Set Spectral Profiles下相应的check box来添加和删除。除此之外,荧光的吸收和发射光谱可以通过同样的操作添加和删除(Spectral Cross Sections)。观察样本的图像会随着滤光片的转换而改变,反应出信号强度和对比度的变化;而这种变化是由滑块移动引起滤光片组合产生的。一个新的目标样本可以通过Choose A Specimen的下拉菜单随时进行,而用于观察的荧光种类就列在下拉菜单中。在任何情况下,样本都经过两种或者多种荧光探针的染色,通过选择的宽窄的带通阻挡滤光片组合来观察。
 
 
奥林巴斯荧光显微镜详细介绍
 
奥林巴斯和尼康的三波段荧光组合主要是为特定的三色荧光组合观察而设计的,而且他们在相似的吸收和发射光谱的其他探针组合中同样有效的观察。利用精确的波段选择,和在反射与传递区的极速转换,多种的激发和发射信号可以在最低的干涉条件下区分开来。为了保持三个不同荧光信号波段的稳定性,这些特制的滤光片组合也可以将多带通特性和多色反光镜结合,这样与特定激发和发射滤光片互补的传递和发射区就可以使用了。每一个尼康的三波段荧光组合都为DAPI、FITC和TRITC优化设计。与这些荧光组合的相关光谱区的范围由紫外激发和蓝光发射到绿光激发和红光发色区域。
  
奥林巴斯和尼康DAPI-FITC-TRITC的三波段滤光片组合一个为紫外区域激发光(385到400nm)设计的激发滤光片结合,这个激发光滤光片伴有一个带通发射滤光片在它最初的信号波段内传递蓝色荧光(450到465nm)。这个滤光片的第二个激发-发射波长组合使蓝光在475-490nm这么窄的波长范围内激发,在505-535nm探测到绿色荧光。第三个荧光信号由绿光区域激发光产生(5450-565nm),这可以引起橙色-红色光发射,探测到580-620nm的波长。这个组合的三色荧光波段可以同时优化DAPI, FITC和RITC组合。尤其是对不同的细胞成分观察时;DAPI, FITC, and TRITC的荧光组合也适合这个滤光片组合使用,这是因为Alexa Fluor 488和MitoTracker Red CMXRos的光谱特性与FITC和RITC的光谱特性相似的缘故。
 
在三色激发模块中,与在其他的多波段组合一样,多色反光镜的设计原则是以分开不同荧光信号为基础的,还可以检测到最小的光谱交叉(spectral bleedthrough)和噪声。与长分光光束器常用于传统的滤光片组合相反的是,多波段组合中使用有几个带通的区域的多色反光镜。典型的是,第一个反光镜的cut-on波长值就在短波长激发光峰值上几纳米处,接着是极速的cut-off,这样可以允许第二个激发波段通过。在三波段滤光片组合中,这个传递-反光模式可以在第三个信号通道中再次重复。在DAPI-FITC-TRITC模式中使用的二色反光镜有多带通传递区域。这些cut-on的波长位于435, 500和570nm。
 
在多波段滤光片组合中应用薄片干涉技术的应用使各荧光信号水平得到平衡,这样可以得到最佳的成像效果。在很多滤光片组合中,短波长激发峰值的传递会降低以平衡两个或者三个发射信号,还可以是光漂白和对样本的毒害降到最低。这一点在为在紫外光谱区有单一荧光激发设计的滤光片组合中尤为重要,因为它可以使较短波长获得高的激发效率。短波长激发峰的密度的显著下降在尼康三波段组合中的传递光谱区域均有体现;也可以通过检测滤光片组合传递光谱区域获得同样的结果。举例来讲,双波段的FITC-Texas Red和三波段的DAPI-FITC-Texas Red组合利用同样的双色反光镜和发射光滤光片,仅仅在激发光滤光片部分有差别,在这两组滤光片组合中第三个短波带通添加到DAPI激发模式下。
 
要想同时检测DAPI, FITC和Texas Red(或相似谱区的荧光),利用DAPI-FITC-Texas Red三激发波段滤光片组合很容易的观察到。紫外激发、蓝色发射光滤光片波段和蓝色激发、绿色发射波段(分别对应于DAPI和FITC)与DAPI-FITC-TRITC组合有类似的特性,但是与TRITC相比,它们的绿色激发红色发射在更长的波段发生。这个组合中使用的激发滤光片一个带通区为395-410nm,发射滤光片的带通区为450-470nm,这些波段适宜DAPI和相似荧光基团观察中使用。第二个波段的激发光在蓝色波长范围490-505nm,检测对应的绿光发射范围在515-545nm(用于FITC及相似荧光基团观察)。Texas Red荧光的信号通道最佳的激发光范围在560-580nm,发射波段是在红光区域的600-650nm处。
 
虽然DAPI, FITC和Texas Red的三波段组合已经达到最佳,但是形同的吸收和发射光谱特性的荧光探针也可以用这个滤光片组合观察。跟DAPI-FITC-Texas Red 模块相比,DAPI-FITC-TRITC模块,具有红色发射光带通可以在较短波长观察情况下调整15nm,产生的图像颜色更偏橙色。DAPI-FITC-Texas Re滤光片组合中的双色反光镜(分束器)的带通区根据激发和发射光滤光片的窗口在445,510和590nm时定位。