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显微镜技术及其功能配置应注意的问题

2013-10-16  发布者:admin 

光学显微镜较为广泛应用于医学实验室,随着近代光学技术的发展及微电子、计算机等技术的融合,更赋予这一传统仪器技术以新的生命力。在掌握必要的显微镜及其各种镜检方法的理论知识基础上,精确进行调试、校准和定期维护,对保证显微镜技术的有效利用及观测质量甚为重要。

单筒显微镜的结构


1 安装与维护
安装与维护是保证显微镜正常使用的基础条件。显微镜应安置在无尘、无振动、无化学腐蚀性暴露、无过度光投照散射、相对湿度低于60%的实验室内。无尘是安装使用光学检测仪器的特定要素,尤其是进行暗场、DIC相差、荧光等镜检时。除要保持室内清洁外,重在对显微镜施实时养护。清洁显微镜光学器件先可用吹气风球吹朔掉表面的灰尘颗粒,随之用专用擦镜纸蘸适量擦镜液(乙醚和乙醇7:3配制的混合液)由内向外螺旋跟进擦拭,而后用干纸擦,再用吹风球吹干;对≥40×物镜前透镜要使用质地较软的木牙签或类似物体磨钝尖端包上至少两层擦镜纸蘸擦镜液轻擦,不能用坚硬的竹牙签,以免牙签透过擦镜纸划伤透镜面。使用油镜后要立即湿擦两次,同时检查相邻的其它倍率物镜是否在转换镜头时沾染上镜油,如有一并擦拭之。但注意不是所有光学部件都可如此擦拭,对镀有特殊光学涂层的偏光镜检的起偏镜及检偏镜、DIC棱镜、荧光激发发射滤光片组件等,平时要常用吹风球吹朔,一旦沾染最好涂液态胶类物质干后揭去粘除污染物。不能用有机溶剂(如高浓度酒精)擦拭镜体。
无振动体现两个涵义。一是安装位置远离振动源,安装台面水平、稳定、无振动,必要时配置专用防震台,配套计算机最好不要与显微镜放在一个台面上且两台间要留有空隙以免联动。二是操作过程无振动,特别是在镜像采集的曝光时间内、显微操作、显微切割等精密环节。
除外荧光镜检,控制室内的光照度和方向非常重要,照明要均匀避免过度炫光。光照不能刺激人眼,也不能直接投照显微镜的光路器件,把显微镜临窗安置是不甚合适的。较长时间不用的可拆卸光学部件要放入干燥罐中保存,并定期更换吸潮剂。在湿度较高季节,室内最好安装除湿机并及时倒掉水箱内的水。


2 调整与校正光源灯丝对中调节
主要是显微镜光学器件的调整、校准及其光学参数设置。


2.1 照明光源灯丝对中
对没有预定灯丝中心的显微镜需要在更换灯泡或搬动显微镜后进行此项调节。方法是缩小视场光阑,在视场光阑处放置乳白磨砂滤光片或一块硫酸纸,可看到灯丝像和缩为点状的视场光阑像呈现。利用灯箱外方的三个调节螺杆进行调节操作,其中一个调整灯泡的聚焦直到灯丝像清晰可见,如点状视场光阑像不在灯丝中央,则用其它两个螺杆做上下、左右
调整,直到灯丝完全调至中央为止,见图1。


2.2 聚光镜光(合)轴调节聚光镜光轴调节
聚光镜光轴偏移产生的问题是视场照明不均,因而此项操作要纳入显微镜的定期校准规程。在明场下,用10×物镜观察标本并完成调焦;将视场光阑尽量缩小、聚光镜孔径光阑开至最大,在视场内可见到视场光阑的轮廊像(视场光阑像不清晰,可稍微调节聚光镜的升降螺旋);如后者不在视场中央,则交替旋调聚光镜外侧的两个调中螺杆将其调至中央部分,而后逐渐地开大视场光阑,能看到光阑向视场周缘均匀展开直至视场光阑的多角轮廓像完全与视场边缘形成内接,表明聚光镜与显微镜光路达到合轴。合轴后再略微开大视场光阑,使轮廓像刚好处于视场外切或稍大一些,这样即适于作镜检观察,调节过程见图2。注意不要忘记将聚光镜升至原位,其透镜距镜台平面0.1mm,焦点位于上方1.25mm处, 如聚光镜低于此位将改变焦点并导致部分光斜照标本产生过多衍射光影响分辨率。倒置显微镜要根据聚光镜标定的工作距离调节聚光镜的位置,实际上当用10×物镜观察到清晰的视场光阑时应当是合适的距离。


2.3 视场光阑调节视场光阑调节
为获得更好的镜像反差,应尽量屏蔽多余的杂散光进入观测镜场或成像区域,在经目镜配合不同倍物镜进行观测时,可调节视场光阑像对应目镜视场形成外切(图3左);在显微摄影或数字CCD成像时,可根据取景框和CCD成像区域再适当缩小视场光阑(图3右),但不要缩过造成照片切角。使用油镜时也可适当缩小调节。


2.4 聚光镜数值孔径的设置
首先,配置聚光镜的数值孔径 (numeric aperture, NA) 范围应与物镜的NA值基本相等,高倍细微镜检时有必要在顶端加油。孔径聚光镜的作用是对应物镜数值孔径提供有效的聚焦投射光,如果设置聚光镜的NA大于物镜NA则一部分光浪费,而过小于物镜NA投射光不足且由于出射角改变使一部分光斜照射标本呈现衍射镜像,两者均会降低镜像的分辨率。因此,应遵循一定的对应设置原则,经验值是镜检观察时为80~100%,摄影时为获得较合适的反差和景深建议设置在60~80%或70~80%。这意味着每转换一种倍率的物镜时,都要根据其NA对聚光镜的NA做出对应设置[2],这样才能保证镜检质量,实际中还可根据标本薄厚、染色深浅进行细调。


2.5 覆盖差校正
标准盖玻片厚度0.17mm、载玻片1.0mm,由于采用不符合标准的盖玻片或载玻片加之切片、封片剂薄厚不均会产生覆盖差,影响较大NA物镜的镜像质量。为校正覆盖差,在40×、60×或20×干系物镜上设计有覆盖差校正环(correction collar, CC),校正范围一般在0.11~0.23mm,长工作距离物镜可至2.0mm。应当精细掌握CC的调节要领,不然反而会带来麻烦,特别是当前一个实验者做了校正而下一个实验者的样片覆盖差不一致时。方法是,先选调CC将0.17数值标线对准定位刻线,观察镜像是否能做到调焦清晰,如不很清晰则分别向左右方向旋调CC环直至镜像达最佳,且要坚持每当更换标本时均应完成覆盖差校正调节才能保证镜检质量。


2.6 光源电压
目前钨卤灯透射光照明主要有6V/20W、6V/30W和12V/100W三种(50W灯源已少见),显微镜通过调节电压控制其功率。在常规镜检,可根据标本的薄厚、物像层次(对光的吸收情况)以及色温来调设电压值,如镜像过亮刺眼可加中密度(neutral density, N或ND)滤光片。值得留意的是在显微摄影时,需根据实际测得的色温值调节电压达到胶片所要求的色温(如日光型胶片5,500~6,000K°或6,500K°,对应电压在9~12V),一旦设定则不能随意再改变电压,只能通过加ND滤光片调节而不影响色温。


2.7 屈光度调节
此项操作很容易被忽略以致实验者眼疲劳,实际上临检级显微镜的目镜筒大多配置有屈光度调节机制。生产厂建议调节方法各异,但如果配置的物镜齐焦常用操作步骤是,先调整好瞳距,用右侧目镜观察完成对焦,而后改用左测目镜观察调节装有的屈光度校正环直至调焦清晰;或先用40×物镜完成镜像对焦,再改用4×物镜用左眼观察,同时旋转目镜筒上的屈光度校正环,直到聚焦镜像最佳。


2.8 常用镜检法的调置
重点讨论以下镜检法操作过程中常易疏漏的调置环节。


2.8.1明场(bright field, BF)
定期进行聚光镜中心调整,实时进行聚光镜与物镜NA的对应数值调设。清洁盖玻片、载玻片,确保没有手印、沾染物。使用油镜时,调焦或移动视野要慢些以维持浸油形成的表面张力保证对焦和孔镜角稳定,兼做荧光观察的物镜最好统一用无荧光油