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实验室内光学显微镜对观察标本的要求

2013-10-16  发布者:admin 

 用于 奥林巴斯显微镜观察的标本必经经过一定的准备过程才能在奥林巴斯显微镜下形成清晰的像,在入射照明和透射照明中,对于标本的光学要求有很大区别,在入射照明中像是由标本的反射光所形成的;相反,在透射照明中像是由透射光所形成的,在这种情况下反射光对于像的形成不仅无益,而且会降低像的清晰度。

  
  用入射光观察的标本,它的准备工作十分简单,只是清洁标本的表面并切割为适当大小的小块。而用透射光观察的标本,必须具有由于光吸收的差异而产生的一定反差,才能在显微镜下被观察到。为此,标本必须经过一系列复杂的处理和制备过程,这种制备技术就是我们一般所说的生物显微技术。
  
  从光学观点出发,对于用透射光观察的奥林巴斯显徽镜标本有如下要求:
  
  (1)适当的厚度。这种厚度在较好的光学系统中能够达到尽可能高的分辨力,并且与这个系统的场深相适应。
  
  (2)足够的透明度。
  
  (3)能够形成建立在吸收差异上的足够的反差。
  
  实际上所有的生物学材料通过石蜡包埋、切片(或涂片)、贴附、溶蜡、透明等过程,能够得到在厚度和透明度上符各要求的标本,然后通过染色程序得到一定程度的反差。
  
  通常在透射式光学奥林巴斯显微镜中所使用的生物学和医学组织切片,它的厚度一般为3-7um。在这个厚度范围内,当使用低倍物镜(例如10x)观察时,场深对于观察整个切片厚度是完全足够的;当使用高倍物镜(例如100x)观察时,场深仅仅是这个切片厚度的很小部分,不断地从上到下移动细调可以得到切片的总体印象。因此,5^-7um厚的常规切片可以被认为是在低放大倍数和高放大倍数理想情况之间的调和,两者都较好地考虑到了场深和分辨力。同时由于种种原因,这种调和的厚度也满足了实际工作中的许多要求,首先物体的细微结构不总是第一重要的;其次在很薄(1-v25m)的切片中生物标本中的立体关系就看不到了;与此相反,当使用8一10um或者更厚的切片时,除了分辨力上可觉察的损失而外,还会引起生物标本中不同层次的互相重益。
  
  经过固定、包埋、切片、溶蜡、透明等处理之后的动植物材料标本是足够薄和透明的了,但是反差很小,并且这种反差主要来自于折射和衍射。显然,这种标本在反差上是远不理想的。但是这可以通过降低折射效果给它覆盖上“吸收物质”,并通过吸收的差异而增大反差。在标本与周围区域之间的折射,可以通过把标本封藏在加拿大树胶或其他人工合成的封藏介质中的方法而减小。所有这些封藏介质经过挥发或聚合使其变硬之后,它们的折射率就接近被固定或被脱水的动植物组织主要成分的折射率。在大多数动植物组织中这个数值为1.51-1.54。同时用这个方法还可以消除盖玻片下面的反射引起的闪光。
  
  已经应用了一个多世纪,并且能够给奥林巴斯显微镜标本带来较好反差的最有效方法是染色。一般没有染色的生物标本,特别是当放置在具有与生物标本相近折射率的介质中时,像的反差是很小的。在染色的标本中,像的反差的增大是建立在染料选择性分布的基础上。染色与未染色标本在反差上有巨大差异。
  
  生物切片经常粘贴在具有26x76mm标准尺寸和1.1^-1.3mm厚度的载玻片上,载玻片的两面应是平行平面。对于载玻件厚度的要求不是很严格的,但是当它的厚度超过一些较高矫正程度集光器的自由工作距离时,载玻片厚度对于聚焦光源以及在物体平面上形成视场光阑的像就变得重要了。对于这种情况,厚度为0.9^-1.0mm的载玻片是比较合适的。