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案例应用

奥林巴斯显微镜激光共聚焦的应用

2013-10-18  发布者:admin 

激光共聚焦显微镜的广泛应用,包括在神经解剖学和神经生理学的各种各样的研究,以及广泛的细胞和组织形态学研究。 此外,越来越多地使用新的荧光共聚焦应用蛋白的数量正在迅速扩大的耦合这些有用的工具,以现代微观调查研究报告原文。 其他应用包括共振能量转移技术,干细胞研究,漂白研究,寿命成像,多光子显微镜,全内反射,DNA杂交,膜和离子探针,生物发光蛋白,抗原表位标记。 下列各节中描述的许多这些强大的技术。

 

在共聚焦显微镜的荧光基团的共定位 -乘法荧光标记标本的检查和数字记录期间,两个或两个以上的发射信号往往可以重叠在最终图像中,由于其靠近内的微观结构。 这种效应被称为共存 ,通常发生在荧光标记分子结合到目标在于非常接近或相同的空间位置。 具有高度特异性的现代化合成荧光和古典免疫技术的应用已显着提高,加上精密光学部分和数字图像处理共聚焦和多光子显微镜所提供的马力,能够检测生物样品中的共存。

荧光探针 -在一般情况下,荧光探针的分类和应用分类根据它们的激发和发射特性,以及它们的化学和生物特性。 本节中的例子在每一个重要的生物类,包括核酸,多糖,脂质,细胞膜,细胞质,离子浓度,特定的细胞器中的探针的制表。 免疫试剂荧光蛋白探针在荧光显微镜具有根本的重要性。

荧光灯和发光蛋白 -在过去的几年中,在调查的基础细胞生物学与绿色荧光蛋白(GFP)和它的许多遗传变异的研究已成为一个主要的主食。 另外,荧光素酶和水母发光蛋白的生物发光蛋白为研究细胞内的离子浓度的波动,和腺苷三磷酸(ATP)的检测,是有用的。 现在市售的这些发光和荧光蛋白的光谱变种,打开多个标签在活细胞实验的可能性。

绿色荧光蛋白(GFP) -绿色荧光蛋白(GFP)及其光谱变体(黄色,YFP),青色(CFP),蓝色(BFP),红色(dsRFP))是在迅速成为重要的研究工具各学科与生命科学领域,包括医学和生物学。 互联网的快速搜索最近的文献揭示每个月几十个或多个报告。 绿色荧光蛋白最初是从水母中分离是一个专门的蛋白质,当暴露于激发光,发出荧光。 其主要用于当前研究的重要性在于在纯化水母GFP基因在其它生物体中表达荧光蛋白的能力。 当一种非特异性的荧光蛋白质(或其变体的嵌合体)的基因导入的组织培养线,整个细胞质发出绿色荧光。

过去几年中,具有几乎跨越了整个可见光光谱的荧光光谱荧光蛋白调色板 -已经开发了一系列广泛的荧光蛋白遗传变异。 诱变广泛的努力,在原来的水母蛋白导致新的荧光探针,该范围内的颜色由蓝色变为黄色,有一些体内报告分子在生物学研究中最广泛使用的。 更长波长的荧光蛋白,散发橙色和红色光谱区域,已制定了从海洋海葵Discosoma芨属于类珊瑚虫和珊瑚。 还有其他物种已被开采产生类似的蛋白质,有青色,绿色,黄色,橙色,红色,和远红光的荧光发射。 发展的研究工作是不断提升的亮度和稳定的荧光蛋白,从而提高他们的整体实用性。

光学荧光笔荧光蛋白质 -蛋白质分子可以激活从静止状态启动荧光(这个过程被称为光活化 ),或能够被光转换荧光发射带宽从一个到另一个( 光电转换 ),代表可能是最有前途的在体内蛋白质的寿命,运输和周转率的调查方法。 适当称为分子光荧光笔 ,一般很少或根本没有显示的光活化荧光蛋白成像波长的激发下初始荧光,但显着提高其荧光强度照射激活后,在不同的波长(通常较低)。 光转化光学荧光笔,另一方面,经过时光学变化的生色团的荧光发射带宽配置的变化。 这些影响导致的直接和受控的高亮显示的不同的分子在细胞内池。

胚胎干细胞 -胚胎干细胞系,这是最初从人类囊胚的内芯,以及其他哺乳动物,现在研究界广泛成立于使用传统的体外培养。 细胞株传代过程中保持其未分化状态和正常核,但是,他们仍然能够分化成几乎任何类型的组织。 第一增殖的胚胎干细胞成为干细胞(如神经元干细胞,肌肉干细胞,血管内皮细胞的干细胞,造血干细胞),根据在特定的培养条件下,然后分化成神经细胞,肌肉细胞,血管内皮细胞和血细胞。 然而,不像受精卵,胚胎干细胞的群集不能独立发展成一个人(或其它动物)。

抗原表位标记的 -抗原表位(也称为抗原决定簇的 )是一种生物结构或序列,如一个蛋白质或碳水化合物,这是作为抗原的抗体,该抗体识别的。 识别的抗原发生适当的结构时,形成的区域中的蛋白质或氨基酸或糖多糖,其中的直线排列。 大多数蛋白质通常有几种表位。 的抗体提供了一个重要的技术(称为免疫测定法 ),用于识别特定的细胞成分(蛋白质,脂类,碳水化合物等)来跟踪感兴趣的活的细胞和固定细胞内的蛋白质的功能,分发和修改。

荧光寿命成像显微术(FLIM) -多色用荧光染料染色观察生物材料(如蛋白质,脂质,核酸,和离子)的分布的组织和细胞的研究领域中积极使用。 荧光观察的检测技术已经发展到一个单一的荧光染料分子的水平下最好的情况下,可以检测到。 本节回顾荧光寿命成像显微镜(FLIM),一个新的荧光显微镜技术的几个重要方面。 此外多色染色,还可以利用荧光寿命成像可视化的因素的影响,也就是说,在分子周围的环境的状态的染料分子的荧光寿命特性。

荧光光漂白调查 -这两种荧光漂白损失( 翻转 )和相关方法漂白后恢复(FRAP)技术通过漂白的荧光观察细胞内的材料的运动。 甲一个浮动的细胞膜上的荧光染料,一种细胞器(内质网和高尔基体)膜,或一个浮动的荧光标记蛋白,这些膜的特定区域的漂白,和被观察到的检查流动性的损失或恢复荧光的横向方向。 FLIP和FRAP的技术也可用来确认膜的连续性。

荧光共振能量转移(FRET) -活细胞中特定的分子物种之间的相互作用的确切位置和性质,是许多生物研究领域的重大利益,但调查往往阻碍了研究这些仪器的分辨率有限现象。 传统的宽视场荧光显微镜观察荧光标记的分子内定义的瑞利判据,约200纳米(0.2微米)的光空间分辨率的限制使本地化。 但是,为了理解在典型的生物分子的过程中涉及的蛋白质贸易伙伴之间的物理相互作用,分子的相对接近必须比衍射极限的传统光学成像方法允许更精确地确定。 时,应用光学显微镜, 荧光共振能量转移 (更通常被称为用首字母缩略词FRET)的技术允许测定两个分子之间的方法,在几纳米范围内的距离足够接近,分子间的相互作用发生。

多光子显微镜 -多光子荧光显微镜是一种强有力的研究工具,它结合了先进的光学技术,长波长多光子激发激光扫描显微镜捕捉到高分辨率三维图像高度特异性荧光标记标本。 该技术具有三维分辨荧光成像的共聚焦显微镜成像活细胞和组织有吸引力的优势。 多光子激发只发生在显微镜的焦点,最大限度地减少漂白和光损伤,活细胞成像的最终限制因素。 这一优势使厚的活组织标本,否则不会有可能与传统的成像技术的调查。

全内反射荧光显微镜 -全内反射荧光显微镜(TIRFM)是一个优雅的光学技术,用来观察单分子荧光表面和界面。 该技术通常采用调查分子相互作用的表面,这是根本的重要性在细胞和分子生物学学科广泛的面积。 全内反射萤光显微镜的基本概念是简单的,只需要一个激发光束通过固体的玻璃盖玻片或塑料组织培养容器,其中细胞粘附旅客在一个较高的入射角。 玻璃相和水相之间的折射率差调节光线如何被折射或反射的界面处作为入射角的函数。 在一个特定的临界角的光被完全反射的光束从玻璃/水界面,而不是通过折射,根据斯涅耳定律。 在水性介质中,具有相同的频率的入射光的反射产生一个非常薄的电磁场(通常小于200纳米)。

纤维的FISH( 荧光原位杂交) -长期纤维的FISH指的普遍做法延长染色质纤维制剂(FISH)进行荧光原位  映射还通过进行FISH调查,在染色体上的DNA片段,在几百万个碱基对的距离之内的信号彼此由于多方面的结构在中期染色体的DNA链是无法区分的。 染色体信号的分辨率提高了,如果之前使用它们进步充分冷凝。 我们可以做些什么,当我们要映射多个相邻的DNA克隆吗? 创建地图规模的一个碱基对整个基因组DNA序列的特性,将解决这个问题,但是是非常耗时的。

cameleons:钙离子的探针 - Cameleons是一类新的活细胞内钙离子浓度的指标,通过构象变化,在钙离子存在下的荧光共振能量转移(FRET)的结果。 在过去,荧光探针,例如,印度的Fura-2和Fluo-3用于测量活细胞内的钙离子浓度的波动是非常普遍的。 在1997年,宫胁淳光,日本理化学研究所脑科学研究所博士开发了一种新型的钙离子探针测量。 探头由人工修改绿色荧光蛋白(GFP)的蛋白质,并命名为卡默莱昂 (变色龙爬行动物后,,但去掉名称中的“H”)。两个荧光蛋白(具有不同的激发和发射特性),钙调蛋白(CAM),肌球蛋白轻链激酶(M13)和钙调蛋白结合域之间的融合产品是仿照的卡默莱昂分子结构。 钙调素结合的与游离的钙离子和M13链后,它已绑定的钙离子与钙调蛋白结合的能力。 直线接合的这四种蛋白质的基因,该融合基因的表达在各种细胞中。

试样制备合成荧光基团和间接免疫荧光 -激光共聚焦显微镜变得不仅仅是一个新奇在20世纪80年代初,由于广角荧光的应用研究细胞的结构和功能上去。 由于免疫荧光技术,以及广泛使用合成荧光染色的细胞结构,成为20世纪70年代中后期实行,显微镜变得越来越沮丧,他们无法区分或记录精细的细节广角仪器由于干扰发生的上方和下方的荧光焦平面。 今天,激光共聚焦显微镜,结合新的先进的合成荧光,荧光蛋白和免疫试剂的应用时,可以探测亚细胞结构的最先进的方法之一。 本节中的地址中所述的协议的试样的制备方法合成的荧光团耦合免疫荧光法是必要的,以固定的贴壁细胞和组织的冷冻切片,使用宽视场和激光共聚焦荧光显微镜调查。

荧光蛋白文学来源 -大大扩展能力,可视化,在光学显微镜下的高时空分辨率的分子事件,荧光蛋白的代表也许是最重要的探头曾经开发细胞和植物生物学调查。 随着互联网的出现,为国际信息传播的一种实用的车辆,大部分的科学出版物已开始使他们的内容上线书的摘要形式,HTML文件和下载的便携文档格式(PDF)文件,可以本地进行查看和打印。 在下面的章节包含列出的参考文献索引服务的链接,以研究者提供了一个快速的途径针对荧光蛋白的原创文学。



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